BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
- - - - -    - - - - -
ĐỖ THỊ THANH THUỶ
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT
CHUẨN EMODIN TỪ ĐẠI HOÀNG
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA
CHẤT LƯỢNG THUỐC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2008
ĐỖ THỊ THANH THUỶ - Luận văn thạc sĩ dược học – Chuyên ngành KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT- 2008
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
- - - - -    - - - - -
ĐỖ THỊ THANH THUỶ
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN
EMODIN TỪ ĐẠI HOÀNG PHỤC VỤ CÔNG
TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất
Mã số : 60 73 15
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS.Trịnh Văn Lẩu
2. ThS. Phạm Thị Giảng

Hà Nội - 2008
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tôi xin chân thành cảm ơn:
PGS. TS Trịnh Văn Lẩu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
Thạc sĩ Phạm Thị Giảng - Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn) 3
1.2. Tổng quan về các vị dược liệu dùng trong nghiên cứu đề tài 3
1.2.1. Đại hoàng (Rhizoma Rhei) 4
1.2.2. Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati) 5
1.3. Khái niệm chung về anthranoid 6
1.4. Emodin 6
1.4.1. Đặc điểm và tính chất của Emodin 6
1.4.2. Tác dụng dược lý của Emodin 8
1.5. Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế
anthranoid 8
1.5.1. Chiết xuất dược liệu 8
1.5.2. Chiết xuất và tinh chế anthranoid 9
1.6. Tổng quan về một số phương pháp hoá lý sử dụng trong
nghiên cứu đề tài 10
1.6.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) 10
1.6.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12
1.6.3. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 16
1.6.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (phổ IR) 16
1.6.5. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17
1.6.6. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 18
1.7. Nhận xét chung 20
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN,
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Nguyên liệu 21
2.2. Phương tiện nghiên cứu 21
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 21
2.2.2. Hoá chất, dung môi 22
2.3. Nội dung nghiên cứu 22
2.4. Các phương pháp dùng để nghiên cứu 23

nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu:
Đại hoàng, Cốt khí củ 67
3.7.1. Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu
Đại hoàng 67
3.7.2. Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu
Cốt khí củ 76
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 88
4.1. Về chiết xuất và tinh chế 88
4.2. Về định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định
nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 88
4.3. Về việc xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 88
4.4. Về định tính, định lượng Emodin tinh chế được, xác
định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được
bằng HPLC 88
4.5. Về việc sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng
thí nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại
hoàng, Cốt khí củ 90
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91
KẾT LUẬN 91
KIẾN NGHỊ 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO 93
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13
C-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance
C : Chuẩn
C + T : Chuẩn + Thử
1
H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance
DĐVN III : Dược điển Việt Nam III

Bảng 1.1. Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 25
0
C 7
Bảng 3.1. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của cắn 1 - Hệ I 29
Bảng 3.2. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của cắn 2 - Hệ I 30
Bảng 3.3. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của cắn 3 - Hệ I 31
Bảng 3.4. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của các phân đoạn
khi khảo sát với hệ dung môi I 35
Bảng 3.5. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của phân đoạn 5
khi khảo sát với hệ dung môi II và III 39
Bảng 3.6. Giá trị R
f
và màu sắc các vết sắc ký của cắn Emodin
khi khảo sát với hệ dung môi I, II và III 42
Bảng 3.7. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cắn Emodin 45
Bảng 3.8. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cắn Emodin 48
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc
ký khi định lượng Emodin tinh chế được 50
Bảng 3.10. Kết quả định lượng Emodin tinh chế được 56
Bảng 3.11. Một số thông số của các pic phụ trên sắc ký đồ của

Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 1- Hệ I 36
Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 2 - Hệ I 36
Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 3- Hệ I 37
Hình 3.9. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 4- Hệ I 37
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ I 38
Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ II 39
Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ III 40
Hình 3.13. Ảnh chụp cắn Emodin 41
Hình 3.14. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ I 43
Hình 3.15. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ II 43
Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ III 44
Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin
tinh chế được 52
Hình 3.18. Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin
tinh chế được 52
Hình 3.19. Phổ UV-VIS của mẫu chuẩn và mẫu thử khi định
lượng Emodin tinh chế được 53
Hình 3.20. Kết quả chồng phổ pic Emodin của mẫu chuẩn và mẫu
thử khi định lượng Emodin tinh chế được 54
Hình 3.21. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic Emodin khi định
lượng Emodin tinh chế được 55
Hình 3.22. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu khi xác định giới hạn tạp
chất liên quan của Emodin tinh chế được 57
Hình 3.23. Sắc ký đồ dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất
liên quan của Emodin tinh chế được 57
Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích
của pic Emodin 61
Hình 3.25. Sắc ký đồ của mẫu trắng – Khảo sát độ đặc hiệu 64
Hình 3.26. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn-Khảo sát độ đặc hiệu 64
Hình 3.27. Sắc ký đồ của mẫu thử-Khảo sát độ đặc hiệu 64

dạng bào chế khác nhau. Trước một thị trường dược phẩm đa dạng như vậy
thì việc tăng cường quản lý Nhà nước để đảm bảo chất lượng thuốc cho nhân
dân luôn được coi là nhiệm vụ chiến lược của ngành Dược nói riêng và ngành
Y tế nói chung.
Một trong những khâu quan trọng trong nhiệm vụ đảm bảo chất lượng
thuốc cho nhân dân hiện nay là công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Trong
công tác này chất chuẩn đóng vai trò rất quan trọng vì nhiều phép thử như
định tính, định lượng, xác định tạp chất đều cần đến chất chuẩn. Đến nay
chúng ta đã thiết lập được hàng trăm chất chuẩn, chủ yếu là chất chuẩn hoá
học có nguồn gốc tổng hợp phục vụ đắc lực cho công tác kiểm tra chất lượng
thuốc. Tuy nhiên vẫn còn rất nhiều chất chuẩn đặc biệt là các chất chuẩn có
nguồn gốc dược liệu chúng ta chưa thiết lập được để đáp ứng yêu cầu của
công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và thuốc đông dược, dược liệu nói
riêng. Một trong số những chất chuẩn hiện nay chúng ta chưa thiết lập được là
Emodin, một hoạt chất có trong các vị dược liệu như Đại hoàng (Rhizoma
Rhei), Hà thủ ô đỏ (Radix Polygoni multiflori), Cốt khí củ (Radix Polygoni
cuspidati), Muồng trâu (Folium Cassiae alatae), Chút chít (Radix Rumicis). . .
Xuất phát từ nhu cầu cần có chất chuẩn để phục vụ công tác kiểm tra
chất lượng thuốc chúng tôi tiến hành đề tài
“
Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn
Emodin từ Đại hoàng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc
”
1
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ
“
Nghiên cứu phát triển bộ dữ
liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác giám sát chất
lượng dược liệu và thuốc đông dược
”

Hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ mà chúng tôi sử dụng trong
nghiên cứu đề tài đều là các vị dược liệu thuộc nhóm dược liệu chứa
anthranoid họ Rau răm (Polygonaceae). Các vị dược liệu này được sử dụng
khá phổ biến trong nhân dân cũng như thường xuất hiện trong các bài thuốc Y
học cổ truyền [21], [22], [23], [24].
3
1.2.1. Đại hoàng (Rhizoma Rhei)
Dược liệu là thân rễ phơi hay sấy khô của nhiều loại đại hoàng như
chưởng diệp đại hoàng, Rheum palmatum L., đường cổ đặc đại hoàng Rheum
tanguticum Maxim.ex Regel (Rheum palmatum L.var. tanguticum Maxim,
hoặc dược dụng đại hoàng, họ Rau răm Polygonaceae [4], [6], [15], [19],
[22], [26].
Đặc điểm dược liệu: Dược liệu là những miếng hình trụ hoặc mặt
phẳng hơi lồi. Mặt ngoài màu vàng nâu. Trên mặt đôi chỗ thấy rõ một mạng
lưới màu trắng, mắt hình quả trám và những ngôi sao nhỏ. Vết bẻ màu đỏ
cam có hạt lổn nhổn [6], [15], [22], [25], [26], [27]. (Hình 1.1)
Thành phần hoá học: Anthraglycosid, anthraquinon tự do (emodin,
chrysophanol, physcion, aloe-emodin, rhein), canxi oxalat, tinh bột, pectin,
chất nhựa [3], [4], [15], [19], [22], [26].
Công dụng: Dùng chữa hạ lỵ, ứ huyết, kinh bế thuỷ thũng, thấp nhiệt
gây vàng da, ung thũng đinh độc. Dùng liều nhẹ làm thuốc giúp sự tiêu hoá,
chữa kém ăn, ăn không tiêu, đau bụng, da vàng. Dùng với liều cao làm thuốc
tẩy nhẹ, dùng cho người đầy bụng, đi lỵ, hoàng đản (da và mắt vàng) [3], [4],
[9], [25], [26].

Hình 1.1. Vị dược liệu Đại hoàng
4
1.2.2. Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati)
Dược liệu là rễ phơi khô của cây Cốt khí củ Polygonum cuspidatum
Sieb.et Zucc., họ Rau răm Polygonaceae [4], [6], [11], [15], [17], [19], [22],

đường. Các dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên chủ yếu là các dẫn chất 9,
10-anthracendion, được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác nhau chủ
chủ yếu là những cây hai lá mầm và trong các họ Caesalpiniaceae,
Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae [12], [13], [26], [30].
1.4. Emodin
1.4.1. Đặc điểm và tính chất của Emodin
Emodin là một anthraquinon tự do có trong một số vị dược liệu như đại
hoàng, cốt khí củ, hà thủ ô đỏ, muồng trâu, chút chít . . . [3], [4], [19], [25]
6
Công thức phân tử: C
15
H
10
O
5
Phân tử lượng: 270,24
Emodin có cấu trúc hoá học như hình 1.4
OH
CH
3
OH
HO
O
O
Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của Emodin
Tên khoa học: 1,3,8-tri hydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedione.
Tính chất:
- Bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam
- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256
o

ATPase [4]. Thử nghiệm
trên chuột cho thấy Emodin có khả năng bảo vệ tế bào gan, phục hồi hoạt
động của tế bào gan nhiễm mỡ, cải thiện tuần hoàn gan, giảm các biểu hiện
bệnh lý của gan [50]. Với liều 75 mg/kg có tác dụng ức chế ung thư vú ở
chuột [4], [25]. Emodin cũng có khả năng chống ung thư phổi, ung thư gan,
ung thư cổ ở người do tác dụng ức chế hiện tượng đột biến gen, gây độc với tế
bào ung thư [35], [37], [39], [40], [51], [52]. Emodin có tác dụng lên màng
sinh học, có ái lực cao với các màng phospholipid vì thế có khả năng kháng
virus, vi khuẩn [36]. Ngoài ra Emodin còn có khả năng chống loãng xương
[46].
1.5. Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế anthranoid
1.5.1. Chiết xuất dược liệu [29]
Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được
các chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần
hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị. Phương pháp chiết
xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương pháp
chiết. Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố
khác nhau:
- Căn cứ vào nhiệt độ:
+ Chiết nóng
+ Chiết nguội
- Căn cứ vào chế độ làm việc:
+ Phương pháp chiết gián đoạn
8
+ Phương pháp chiết bán liên tục
+ Phương pháp chiết liên tục
- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha:
+ Phương pháp chiết ngược dòng
+ Phương pháp chiết xuôi dòng
+ Phương pháp chiết chéo dòng

Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha:
pha động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao
đổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần
phân tích. Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và
pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các
thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên
pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu
các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm,
366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết
bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả
kiến của chất cần phân tích . . . Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta
có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong
hỗn hợp cần phân tích.
1.6.1.2. Các đại lượng đặc trưng
a. Hệ số lưu giữ R
f:
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ
số lưu giữ R
f
. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển
của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
10

d
d
R
M
R
f

r
càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)
1.6.1.3. Ứng dụng
a. Định tính:
Thường dựa vào trị số R
f
của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong
cùng điều kiện. Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyến
dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối R
r
để đặc trưng
cho chất phân tích.
b.Thử tinh khiết:
Dùng SKLM để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các
vết lạ trên sắc ký đồ
c. Định lượng:
Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký
• Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích
hợp. Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ
thuật thích hợp như phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ Phương pháp
này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở ngại lại mất nhiều thời gian.
11