PHẦN MỘT:
MỞ ĐẦU
I.1. Đặt vấn đề
Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) đã được biết đến và trồng từ rất lâu
đời. Năm 1994 diện tích đậu tương trên thế giới khoảng 61571000 ha với năng suất bình
quân đạt 2078 kg/ha. Sản lượng đạt trên 10 triệu tấn/năm. Điều đó khẳng định cây đậu
tương là một trong những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp.[2]
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành là loại cây họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm của
hạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giầu giá dinh dưỡng chính vì vậy là cây thực
phẩm có vai trò quan trọng cho con người và gia súc. Từ hạt đậu tương có thể chế biến
được nhiều các sản phẩm khác nhau như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn, đậu
phụ, tào phớ, sữa đậu nành,… là những sản phẩm công nghiệp được chế biến từ đậu
tương rất có lợi cho sức khoẻ con người, góp phần chống suy dinh dưỡngvà các bệnh
thần kinh, tim mạch. Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậu tương
có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể là 12-24%. Bên cạnh đó, do có khả năng cố định đạm
tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương là cây trồng bảo
vệ đất chống xói mòn. Cuối cùng cây đậu tương còn góp phần giải quyết công ăn việc
làm, tăng thu nhập cho người nông dân [2].
Nền nông nghiệp nước ta đã phát triển cùng với nền văn minh lúa nước, tất nhiên
không vì thế mà cây đậu tương mất đi chỗ đứng của nó. Đậu tương nằm trong những
cây trồng quan trọng và việc phát triển đậu tương cũng đã được chú trọng. Tuy nhiên,
năng suất của cây đậu tương thường rất thấp bởi đang bị ảnh hưởng của hạn hán và dịch
bệnh. Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và năng suất của cây đậu
tương. Bên cạnh đó còn có sự phá hoại của năm loại dịch bệnh phổ biến tấn công đậu
tương, đó là bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử, tàn lụi vi khuẩn, đốm lá [1, 3]. Các
loại bệnh hại này và hạn hán đã gây tổn thất không nhỏ đối với năng suất đậu tương.
Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học thì chi phí sản xuất cao và gây ảnh hưởng đến môi
trường.
Rõ ràng, đậu tương là cây thực phẩm thiết yếu, nhưng năng suất của các giống
đậu tương hiện nay lại đang bị ảnh hưởng bởi hạn hán và sâu bệnh hại. Chính vì lẽ đó
1

(1) Xác định quy trình khử trùng mẫu để tạo mẫu sạch và môi trường nuôi cấy
thích hợp.
(2) Xác định nồng độ của BAP lên khả năng tạo thể protocorm ở mỗi giống là
cao nhất.
(3) Xác định nồng độ của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm của
hai giống là lớn nhất.
I.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
I.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu tương DT84, DT2001
I.3.2. Phạm vi nghiên cứu
* Địa điểm: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp (Km 2 Đường
Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội)
* Thời gian: từ 23/2/2011 đến 22/5/2011.
* Điều kiện nghiên cứu:
- Phòng nuôi cấy:
. Nhiệt độ: 25
0
C.
. Cường độ ánh sáng 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 10giờ/ ngày.
- Các dụng cụ, buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt.
* Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy.
- Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin B5, phytagel, MES, các chất điều hòa
sinh trưởng: BAP, Zeatin, GA
3
, Glutamin, Asparagin. Nguồn cacbon: Đường saccaroza.
PHẦN HAI:
3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
II.1. Lịch sử phát triển, cơ sở khoa học và kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

thống có rễ phụ. Giai đoạn này làm cơ sở cho việc chọn mẫu cấy và những nghiên cứu
về thành phần môi trường ở các giai đoạn sau.
Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công
trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh.
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi
White (Hoa Kỳ) nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum)
trong thời gian dài bằng muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó, nước
chiết nấm men được thay thế bằng 3 loại vitamin nhóm B: thiamin (B1), pyridoxine
(B6) và nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn được tiến hành
ở nhiều cây khác nhau.
Cũng trong năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA (Indol
Acetic Acid), một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích
sự tăng trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi
cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và
thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng
hợp thành công, như Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid
(2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D giúp tạo mô sẹo, gây
phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin
– một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy.
Năm 1957, Skoog và Miler công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nồng
độ các chất auxin/ cytokinin trong môi trường phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) của mô
sẹo ở thuốc lá. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin < 1 thì mô có xu hướng hình
thành chồi. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin > 1 mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Tỷ lệ
auxin/ cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển.
Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng
cách sử dụng máy lắc.

hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng giai
đoạn phát triển của phôi.
6
Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống,
chọn tạo giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di
truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình chọn
giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8].
II. .1.2.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam
Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975. Phòng nuôi
cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam do Tiến Sĩ
Lê Thị Muội đứng đầu.
Nhận thức được triển vọng to lớn của nuôi cấy mô trong chọn giống và nhân
giống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tự nhiên
và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiên cứu Hạt
Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa
học và đào tạo cán bộ nghiên cứu vào ngành này (Trần Văn Minh, 1999) [7].
Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt
Nam đã đạt một số thành tựu như sau [8]:
- Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L..) tại Viện Công Nghệ Sinh học.
- Nhân giống vô tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn
Uyển).
- Nhân giống chuối (Mus a spp)
- Nhân giống cây bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị Ái Thuyền.
- Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An.
- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống mía đường (Sacharum offciarum),
nhân giống cây Vani (Vanilla sp) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên)
II.1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân

hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô
8
bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn
nước và dẫn dinh dưỡng.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng
không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều
kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá
trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Qúa trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được biểu diễn dưới sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Trong đó:
+ Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu.
+ Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt.
+Tế bào chuyên hóa là các tế bào đã mang chức năng riêng biệt [15].
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế
các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene được
hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gene khác
lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu
trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể
thực vật luôn được hài hoà.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể bình thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng
khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết
quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho đến
cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách
rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và
phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự

nhau của cây, tạo mô sẹo nhân cây in vitro.
* Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh
Thường sử dụng là các mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến
1,0 mm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới
hình thành và các cành non.
Khi sử dụng các mô phân sinh cần phải cân bằng giữa các chất điều hòa sinh
trưởng.
Ứng dụng: Tạo cây sạch virus, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử lý
Conxixin [16].
* Nuôi cấy bao phấn
Đã có rất nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển
thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi
trực tiếp và gián tiếp trung gian qua mô sẹo và tạo cơ quan.
10
Ứng dụng: Tạo các dòng thuần, biểu hiện các gen lặn, cây đơn bội thu được từ
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là nguồn nguyên liệu cho chọn dòng đột biến.
* Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần
Năm 1960 Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào và đã tạo ra một số lượng lớn
tế bào trần. Khi tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào chúng được nuôi riêng rẽ.
Ứng dụng: Là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ở
thực vật bằng phương pháp dung hợp 2 loại tế bào trần để tạo các cây lai soma.
* Nuôi cấy mô sẹo
Các mô đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt hóa tạo
thành mô sẹo.
Có thể sử dụng bất kỳ bộ phận dinh dưỡng nào của cây: Mảnh lá, thân, rễ làm vật
liệu nuôi cấy tạo mô sẹo hoặc có thể sử dụng hạt gieo trên môi trường thích hợp đến khi
phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân thành những đọan nhỏ và đưa vào môi trường tạo
mô sẹo (cà chua).
Nên sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất bởi vì
tế bào mô sau khi cấy chuyển nhiều lần dễ phát sinh đột biến.

Khi được nuôi cấy invitro thường thì các tế bào thực vật không có khả năng
quang hợp. Do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn Cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng
của tế bào.
Nguồn Cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là sucrose, một số
trường hợp sử dụng Glucose và fuctozose thay thế cho Sucrose nhưng chúng thường
nghèo hydrat cacbon đối với cây.
Khi khử trùng chú ý không nên để quá lâu để tránh hiện tượng caramen hóa xảy
ra làm cho môi trường chuyển sang màu vàng ức chế sự phát triển của tế bào.
* Các muối khoáng đa và vi lượng.
Với cây trồng thì các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng.
Nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, Mg, S và Ca. Các nguyên tố đa lượng này
thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch. Đây là nguyên liệu để những tế
bào hình thành nên cấu trúc của mình.
Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn,
Mn, Bo, I, Co. Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triển
bình thường. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác cho phản
ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào.
* Các vitamin
12
Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy invitro ở các
loài khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản
nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng tốt nhất phải bổ sung
thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và aminoacid. Trong các loại vitamin,
B
1
được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B
3
) và
pyridoxune (B

* Nhóm Cytokinin
- Các Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi. Trong môi
trường nuôi cấy tỷ lệ Auxin/ Cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóa chồi từ
mô sẹo, tạo phôi vô tính.
- Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, 2iP.
+ Kinetin (6 - fafurolaminoprrine) hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt
độ cao từ chế phẩm ADN có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi.
+ Zeatin (6 – hydoxy - 3 - methylbut - 2 enl amino purin) thực chất là một dẫn
xuất của adenin có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá quá đắt nên ít sử dụng.
+ BAP (6 - benzyl amino purine) có hoạt tính cao hơn kenitin và bền với nhiệt
độ cao, hơn zeatin.
+ 2ip (Isopentenil- adenine)
Chức năng chủ yếu của Cytokinin trong quá trình phân bào là kích thích sự
phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy, tăng diện tích phiến lá, tạo
chồi bất định (nồng độ cao) ức chế quá trình già hóa, kích thích tạo diệp lục, ức chế sự
kéo dài chồi, ức chế sự hình thành rễ, có thể làm tăng sự phát triển mật độ khí khổng ở
một số loài [17]. Cytokinin được pha bằng dung dịch HCl loãng.
* Gibberilin (GA
3
): là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong nhóm gibberilin có
hơn 20 chất.
Thường ít thấy sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bởi nó ức chế sự phát
triển mô sẹo và hình thành rễ bất định, do hoạt động của mô sẹo chúng được sử dụng
trong nghiên cứu về sự tạo hình.
GA
3
tan được trong nước nhưng trong môi trường axit, nhiệt độ cao thì GA
3
mất
họat tính sinh học.