BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------------------

BÙI THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG
NƯỚC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ KÍCH THÍCH
SỰ NẢY MẦM CỦA LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------------------

BÙI THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG
NƯỚC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ KÍCH THÍCH
SỰ NẢY MẦM CỦA LÚA
LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngành:

Công nghệ Sinh học

Mã số:

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này:
Trước hết tôi xin gửi đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ
nhiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường niềm kính trọng, sự tự hào được học
tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho PGS.Ts Trang Sĩ Trung – hiệu
trưởng trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt kiến thức,
kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Đặc biệt xin được ghi nhớ và chân thành cảm ơn đến NCS Nguyễn Công Minh
đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt
quá trình.
Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh
học – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm –
Khoa Công nghệ Thực Phẩm – trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo
điều kiện thuận lợi về hóa chất, dụng cụ, thiết bị… cho tôi trong suốt quá trình.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện,
động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua cũng
như thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Khánh Hòa, Ngày tháng
Tác giả luận văn

năm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ...................................................................... vii
TRÍCH YÊU LUẬN VĂN .............................................................................................. x

2.1.1. Chitosan ........................................................................................................28
2.1.2. Lúa giống ......................................................................................................28
2.1.3. Hoá chất ........................................................................................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................29
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .................................................................29

iii


2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan bằng phương pháp
rắn ........................................................................................................................... 30
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan ..30
2.2.2.2. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khả năng tạo muối chitosan ...45
2.2.2.3. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan/acid lactic đến khả năng tạo muối
chitosan ................................................................................................................46
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan bằng phương pháp
sấy phun ..................................................................................................................34
2.2.3.1. Ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan .....................34
2.2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng tạo muối chitosan .......36
2.2.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy – nhiệt độ tách ẩm đến khả năng tạo muối
chitosan ................................................................................................................37
2.3. Các phương pháp phân tích .................................................................................40
2.3.1. Phương pháp phân tích hóa học ....................................................................40
2.3.2.Phương pháp xác định các chỉ tiêu vật lí của lúa giống ................................ 41
2.4.

Phương pháp xử lí số liệu ...............................................................................41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................42
3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan hòa tan trong nước .....................42



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA:

Abxixic

CK-L:

Đóng gói chân không (95%) và bảo quản ở nhiệt độ lạnh (8-100C)

CK-RT:

Đóng gói chân không (95%) và bảo quản ở nhiệt độ phòng

COS:

Oligochitosan

CTS:

Chitosan

GA:

Gibberellin

GAPDH:



T-RT:

Đóng gói thường và bảo quản ở nhiệt độ phòng


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan .......................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc của chitosan và các đồng phân của chitosan ..................................5
Hình 1.3. Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan ......................................................6
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của muối chitosan..........................................................10
Hình 1.5. Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan ............................. 13
Hình 1.6. Cấu tạo của hạt lúa ......................................................................................14
Hình 1.7. Quá trình nảy mầm và phát triển của cây lúa ..............................................15
Hình 1.8. Quá trình biến đổi dẫn đến nảy mầm của hạt lúa .......................................16
Hình 1.9. Cơ chế kéo dài tế bào của các chất kích thích .............................................19
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................29
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo
muối chitosan ..................................................................................................31
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định kích thước của chitosan ban đầu ..................32
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định tỉ lệ acid tạo muối chitosan ..........................36
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định loại acid tạo muối chitosan ..........................35
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ của chitosan trước khi sấy .............36
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nhiệt độ sấy muối chitosan..........................37
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện bảo quản muối chitosan……..38
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ muối chitosan thích hợp ................39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại acid đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến của muối chitosan
sản xuất bằng phương pháp rắn ......................................................................42
Hình 3.2. Muối chitosan được sản xuất bằng phương pháp rắn .................................43
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kích thước chitosan ban đầu đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến

Hình3.19. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan lactate sản xuất theo phương pháp
rắnđến chiều dài thân và chiều dài rễ của cây mạ. .........................................65
Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến
hàm lượng ẩm của cây mạ. .............................................................................66
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến
hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotene của cây mạ ...................67
Hình 3.22. Các mẫu lúa được kích thích bằng muối chitosan lactate sản xuất theo
phương pháp rắn ............................................................................................. 68
Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy
phun đến khả năng nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm của cây mạ...........................69
Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy
phunđến chiều dài thân và chiều dài rễ của cây mạ........................................70
Hình3.25. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy
phun đến hàm lượng ẩm của cây mạ. ............................................................. 71
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy
phun đến hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotene của cây mạ ...71
Hình 3.27. Các mẫu lúa được kích thích bằng muối chitosan lactate .........................72


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tính chất của một số loại chitosan thương mại ................................................4
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn dài giới hạn,
độ trương nở của màng chitosan với độ deacetyl khác nhau ..........................5
Bàng 1.3. Các thông số hóa lý của vi hạt chitosan ............................................................9
Bảng 1.4. Chế độ cắt mạch và độ nhớt của các sản phẩm chitosan ............................... 11
Bảng 3.1. pH của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp rắn..................................44
Bảng 3.2. Trạng thái của muối chitosan lactate với kích thước chitosan ban đầu khác
nhau sản xuất bằng phương pháp rắn ............................................................. 46
Bảng 3.3. Trạng thái của muối chitosan lactate với tỷ lệ chitosan/acid khác nhau sản
xuất bằng phương pháp rắn ............................................................................48

nảy mầm tốt, tỷ lệ nảy mầm cao, độ dài rễ, thân cao hơn so với mẫu không kích thích.
Từ khóa: chitosan hòa tan trong nước, muối chitosan, sấy phun, phương pháp rắn, lúa.


MỞ ĐẦU
Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo bởi các hợp phần
glucosanmin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4. Chúng được
tách chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên
thế giới chỉ sau xenluloz. Chitosan có nhiều tính chất sinh học quý báu như kháng
khuẩn, kháng nấm, khả năng tự phân hủy sinh học, không gây độc, kích thích sinh
trưởng thực vật… Vì vậy chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, y học, dược học…
Ngày nay, muối chitosan là một trong những dẫn xuất được sử dụng thường
xuyên để sản xuất thuốc. Một số muối chitosan như glutamate, aspartate,
hydrochloride và acetate đã được sử dụng để sản xuất các loại thuốc trị đại tràng và
tăng cường việc cung cấp các peptide để chữa bệnh qua biểu mô ruột (Orienti và cộng
sự,2002).

Một số tác giả cho thấy acid ascorbic hỗ trợ chitosan trong quá trình bao

bọc chất béo thông qua quá trình nhũ hóa trung gian của acid ascorbic (Tsujikawa và
cộng sự, 2003). Theo Senel và cộng sự (2000) đã chứng minh cho thấy chitosan hòa
tan trong dung dịch acid loãng có thể làm tăng khả năng hấp thụ peptid trên niêm mạc
miệng lợn. Ngoài ra, một bằng chứng khác là với nồng độ 40ppm oligoglicosamin làm
tăng cường lượng diệp lục trong lá và lượng nốt sần chứa nito, năng suất cây lạc tăng
từ 19,34% đến 40,65% (Lehduwi và cộng sự, 1997; Chandkrachang, 2002)
Các đặc tính của chitosan phụ thuộc nhiều vào dung môi hòa tan. Thông thường
chitosan hòa tan tốt trong môi trường acid yếu như acid acetic, acid lactic, acid focmic...
Hạn chế lớn nhất của chitosan là không tan trong nước và dung môi hữu cơ. Đã có nhiều
công trình công bố đưa ra các giải pháp khác nhau như bẻ ngắn mạch chitosan, thực hiện

glucosanmin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4. Chúng được
tách chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên
thế giới chỉ sau xenluloz.

Hình1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan (Trang Sĩ Trung, 2010)
Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là polyβ -(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose.
Công thức phân tử: (C6H11O4N)n.
Phân tử lượng: Mchitosan= (161,07)n
1.1.1.2.

Tính chất của chitosan

-

Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy có màu đục

-

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm.

Nhưng hoà tan trong dung dịch acid loãng, tạo thành dung dịch keo dương. Nhờ đó,
keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb3+,
Hg+,…

3


Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một

-


Hàm lượng khoáng Ðộ deacetyl
(%)
(%)

Mật độ khối
(g/ml)

Ðộ nhớt
(cps)

1

7,13 ± 0,00

0,3 ± 0,1

90,6 ± 0,0

0,26 ± 0,02

120 ± 3

2

7,16 ± 0,03

0,2 ± 0,1

89,9 ± 1,1


7,00 ± 0,05

1,7 ± 0,3

86,9 ± 1,1

0,20 ± 0,01

768 ± 8


Bảng 1.2. Ảnh hưởng của hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn
dài giới hạn, độ trương nở của màng chitosan với độ deacetyl khác nhau (Trang Sĩ
Trung, 2009)
Ứng suất kéo
(N/mm3)

Ðộ giãn dài giới hạn
(%)

Ðộ trương nở
(%)

Dung môi

Chitosan
độ
deacetyl
thấp


0,95

1,95

403,90

69,81

Acid acetic

27,91

40,53

0,84

1,70

359,00

65,69

Acid
glycolic

18,78

35,71


R’=CH2CH(OH)CH2N+(CH3)3Cl-) (Tungtong và cộng sự, 2012)
5


Hình 1.3. Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan (Nutraceutical, 2009)
Một số dẫn xuất nữa của chitosan được thể hiện ở hình 1.3. Ta thấy có thể tạo
nhiều dẫn xuất chitosan bằng các phản ứng hóa học khác nhau. Tạo ra các đồng phân
có tính chất khác nhau và có tính hòa tan cao hơn đáng kể so với chitosan gốc. Ví dụ:
Chitosan----sulfation anticoagulant; Chitosan----O-acylation emulsifier; Chitosan
-----O-IN-carboxy alkylation moisture retainer (sản phẩm chăm sóc da)

(B.

Nutraceutical, 2009).
Quá trình phân hủy hoặc thủy phân chitin/chitosan tạo ra được chitosan có khối
lượng phân tử thấp gọi là chitooligosacarit cũng có khả năng hòa tan trong nước ở dải
pH rộng (pH = 5÷8).
1.1.1.3.

Ứng dụng của chitosan

Khả năng ứng dụng của chitosan theo nhiều hướng khác nhau, chẳng hạn như
trong thực phẩm và dinh dưỡng, công nghệ sinh học, khoa học vật liệu, thuốc và dược
phẩm, nông nghiệp và bảo vệ môi trường, gần đây được sử dụng rất tốt trong liệu pháp
gen. Mạng lưới ion điện tích dương cũng như sự hiện diện của nhiều nhóm chức năng


làm cho phân tử chitosan là phân tử sinh học được chào đón. Ý nghĩa đối với y sinh
học và điều trị của các dẫn xuất chitin/chitosan là một chủ đề quan tâm đáng kể của
nhiều người trên khắp thế giới. Tính kháng khẩn, tính chống oxy hóa, tính tạo kết cấu,

cản khí tốt. Những màng này sử dụng trên các loại thực phẩm bao gồm các loại trái
cây, rau quả, kéo dài thời gian bảo quản của chúng bằng cách chống khí và độ ẩm và
còn có khả năng kháng khuẩn của màng chitosan. Với khả năng chống oxy hóa, kháng
khuẩn và đặc tính thấm của màng, chitosan có thể được sử dụng để tạo lớp màng phủ
cho các sản phẩm thực phẩm.
Nhiều nhà nghiên cứu xác định, chitosan và oligomer có hiệu quả trong việc
làm giảm thấp mức độ lipoprotein (LDL) cholesterol trong gan và máu. Chitosan giúp
giảm sự hấp thụ chất béo bằng cách giữ chất béo trung tính như cholesterol và sterol
khác, bằng tương tác kỵ nước. Vì hoạt động ức chế này hấp thụ chất béo, gom những
phân tử đóng vai trò như chất béo trong đường tiêu hóa, và loại bỏ chất béo,
cholesterol thông qua bài tiết. Bên cạnh chitosan, oligomer chitosan có khối lượng
7


phân tử trung bình 10.000 Da có thể tăng cường đáng kể quá trình bài tiết steroid trung
tính từ phân. Nó cũng có thể tăng cường hoạt động lysozyme trong máu và các mô.
Các polysaccharide cũng thuận lợi cho quá trình chuyển hóa đường lactose.
Oligosaccharide chitosan hoạt động như một chất kích thích tăng trưởng có chọn lọc
của lactobacilli và bifidobacteria (Nutraceutical, 2009).
Các ứng dụng trong y tế của chitosan bao gồm đa dạng nhiều lĩnh vực bao gồm
việc sử dụng như màng lọc máu, da nhân tạo, vật liệu mang thuốc và cũng là một chất
cầm máu.
Trong công nghệ sinh học, chitosan sử dụng như một mạng lưới để cố định các
enzyme và các tế bào vi khuẩn.
Chitosan là một bazo yếu với pKa = 6,2 - 7 (Kerch và cộng sự, 2010) nên
không tan ở pH trung tính và kiềm. Chitosan tan ở trong nước ở pH thấp hơn 6,5, tại
đó nhóm amin của chitosan được ion hóa. Nói chung là chitosan tan trong các dung
dịch có tính acid như acid acetic, acid lactic và acid clohydric loãng (Cardile và cộng
sự, 2008) do đó gây khó khăn khi ứng dụng và khi áp dụng quy mô lớn. Chitosan hòa
tan trong nước có tính tiện dụng cao tuy nhiên các đặc tính cơ bản của chitosan hòa tan


Ðộ ẩm (%)

Mật độ (g/cm3)

Ðường kính
(µm)

Cầu thể
(dmin/dmax)

Chitosan acetate

10,18

1,1460

3 - 16

0,8 - 0,9

Chitosan ascorbate

3,37

1,4332

2-4

0,9

dịch acid lactic, acid citric và acid acetic để tạo dung dịch chitosan 4%. Các mẫu được
để trong 24 giờ cho tan hoàn toàn. Tỷ lệ chitosan/acid hữu cơ là 1/24. Sau đó đem sấy
phun bằng máy sấy phun Buchi B -191 của Thụy Sỹ. Với kích thước vòi phun 0,7 mm.
Tốc độ dòng sấy phun 558 ml/h. Tốc độ luồng khí nén là 600 l/h, tốc độ không khí 60
m3/h và áp suất không khí là 42mbar. Thu được độ nhớt của muối acetate (273.6
mPas) > muối chitosan lactate (249.0 mPas) > muối chitosan citric (220.9 mPas).
Muối chitosan acetate có độ ẩm cao hơn muối chitosan lactate và muối chitosan citrate
(Cervera và cộng sự, 2011)
9


Cơ chế: Chitosan là một bazơ, dễ tạo muối với các acid, hình thành những chất
điện ly cao phân tử có tính tan phụ thuộc vào bản chất của các anion có liên quan.
Chitosan và acid liên kết với nhau bằng liên kết tĩnh điện thay vì liên kết cộng
hóa trị. Ở vị trí C2 của chitosan, acid sẽ liên kết vào để hình thành phân tử mang điện
tích dương (Li và cộng sự, 2007)

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của muối chitosan
1.1.2.2.

Chitosan phân tử lượng thấp (oligochitosan – COS)

COS là chitosan có trọng lượng phân tử thấp. Chúng độ trùng hợp n ≥ 20 (n ≈ 20 ÷
40). COS được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau.
-

Phương pháp hóa học : Dùng tác nhân hóa học để thủy phân
Có nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân

chitosan để thu chitosan PTLT hoặc COS: acid acetic, acid sulfuric, acid


Ðộ nhớt
(mPa/s)

Nồng
độ
H2 0 2
(%)

Nhiệt
độ

100

1,40

40

1,9

10

1,65

65

5

1,7


(0C)

Thời
gian
(giờ)

1,35

35

1,69

0,05

30

1,0

3,4

1,60

60

3,04

1,62

60


11


quy mô lớn như: Chi phí sản xuất cao do công đoạn tinh sạch sản phẩm khó khăn, qui
trình sản xuất phức tạp, tính đặc hiệu của enzyme cao nên có những enzyme chỉ cắt
liên kết giữa các đơn vị có chứa nhóm acetyl, hoặc chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị đã
bị khử nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao.
Năm 2006, GS.Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất COS có nguồn gốc từ
chitin, chitosan bằng enzyme papain, hemicellulose, enzyme cellulase từ xạ khuẩn .
Theo tác giả Trần Thị Luyến khi dùng enzyme papain chiết rút từ đu đủ xanh, kết quả
thu được 95% COS từ chitosan. Khi dùng enzyme thương phẩm thì thu được 97%
COS. Khi dùng enzyme hemicellulose thương phẩm, kết quả thu được 88,9% COS từ
chitosan và 86,7% COS từ chitin. Khi dùng enzyme cellulase từ xạ khuẩn sẽ thu được
52,6% COS từ chitosan và 45,6% COS từ chitin.
-

Phương pháp vật lý
Wasikiewicz và cộng sự, 2004 đã dùng tia gamma, tia UV và sóng siêu âm để

thủy phân chitosan. Kết quả thu được COS có phân tử lượng khá thấp (> 25kDa). Tuy
nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chitosan phải hòa tan trong môi trường
acid trước khi thủy phân với nồng độ thấp (0,1 – 1)% và thời gian thủy phân dài, nên
đã gây khó khăn cho quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp (Jaroslaw và cộng sự,
2005).
Czechowska-Biskup và cộng sự (2005) đã thử nghiệm với phương pháp vật lý
để thủy phân chitosan thu được COS đồng thời thử nghiệm khả năng kết hợp giữa
COS và chất béo với mục đích ứng dụng COS trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức
năng để làm giảm khả năng hấp thụ chất béo của con người (với 1g chitosan có thể hấp
thu 8 – 20g chất béo) Hình 1.5


Bộ (Drdo): Poales
Họ (Familia): Poaceae
Chi (genus): Oryza
13