ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Xuân Toàn

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH
CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC
GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Xuân Toàn

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH
CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC
GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN HÀ


góp ý và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu .
Hà Nội, ngày tháng

năm 2015

Học viên

Lê Xuân Toàn


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của r iêng tôi.
Các số liệu, kế t quả nêu trong luâ ̣n văn là trung thực và chưa từng đươ ̣c ai công
bố trong bấ t cứ công triǹ h nào khác .
Tác giả

Lê Xuân Toàn


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................6
1. Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài....................................................................6
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................7
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..............................................................................................9
1.1. Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự ...............................9
1.1.1. Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự ...........................................9

2.3.2. Phương pháp nghiền mẫu............................................................................32
2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kit PrepFiler® ...............................32
2.3.4. Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết ..................................................39
2.3.5. Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR ....................40
2.3.6. Điện di và phân tích kết quả ........................................................................41
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................43
3.1. Kết quả định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiết .......................................43
3.2. Kết quả điện di đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian dƣới 2 năm ..46
3.2.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 1....................................................46
3.2.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 2....................................................48
3.2.3. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 3....................................................49
3.2.4. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 4....................................................50
3.2.5. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 5....................................................51
3.2.6. Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời
gian dưới 02 năm ...................................................................................................52
3.3. Kết quả tách chiết đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian từ 02 - 10
năm: ..........................................................................................................................53
3.3.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 6....................................................53
3.3.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 7....................................................54
3.3.3. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 8....................................................56
3.3.4. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 9....................................................58
3.3.5. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 10..................................................59
3.3.6. Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời
gian từ 02 đến 10 năm ...........................................................................................60
3.4. So sánh kết quả phân tích ADN ở các mẫu hài cốt .......................................62
3.5. Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler® .66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................73

2

3


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Hình 1.5. Cấu tạo răng hàm
Hình 2.1. Mẫu răng, xương có thời gian dưới 02 năm
Hình 2.2. Mẫu răng, xương có thời gian từ 02 - 10 năm
Hình 2.3. Ảnh kết quả Realtime PCR trên máy Eco™ Real-Time PCR System
(hãng Illumina – Mỹ)
Hình 3.1. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 4
đối với mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm (răng số 1 và xương số 1)
Hình 3.2. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số giữa thí nghiệm 3,6,7,8 và 9
Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 1 - răng số 1
Hình 3.4. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 2 - răng số 1
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 3 - xương số 1
Hình 3.6. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 4 - răng số 1
Hình 3.7. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 2
Hình 3.8. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 3
Hình 3.9. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 6 - răng số 4
Hình 3.10. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - răng số 4
Hình 3.11. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - xương số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 8 - răng số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 9 - răng số 4
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số 5
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 10 - răng số 6

4


Phản ứng khuếch đại gen

RFLP

Restriction Fragment Length

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

bp

Nghĩa tiếng việt

Polymorphism
rfu

Relative fluorescent units

Đơn vị huỳnh quang

rpm

Rovolutions per minute

Số vòng quay mỗi phút

STR

Short Tandem Repeat


bằng hệ gen ty thể thì không thể phân biệt từng cá thể do đặc điểm di truyền theo dòng
mẹ. Nhưng nếu thu được vài locus gen nhân tế bào, đã có thể truy nguyên chính xác
danh tính của liệt sĩ, thông qua những người thân của họ. Mặt khác, đối với các hài cốt
liệt sĩ thì lượng răng và xương thu được là hạn chế, nên cần phải tiến hành phân tích
trên lượng mẫu tối thiểu do đó việc lựa chọn một quy trình tách chiết hiệu quả là bước

6


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

quyết định sự thành công trong công tác giám định ADN nhân tế bào từ các mẫu hài
cốt.
Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách
chiết ADN từ những dấu vết có số lượng ít, chất lượng thấp (hay còn được gọi là vi
vết) như: dấu vết tế bào để lại thông qua việc cầm, nắm hay dấu vết nước bọt trên
miệng chai nước, trên đầu lọc thuốc lá... cho kết quả tốt. Vậy có thể sử dụng bộ kit này
để tách chiết ADN từ hài cốt, một đối tượng cũng có hàm lượng ADN thấp và rất khó
tách chiết hay không?
Để góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, việc lựa chọn đề tài „Nghiên
cứu ứng dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt
phục vụ công tác giám định ADN tại Việt Nam‟ với mong muốn nâng cao hiệu quả
của việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương là rất cần thiết.
2. Mục đích nghiên cứu
2.1. Phân tích, đánh giá việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết ADN
nhân tế bào từ hài cốt.
2.2. Đưa ra được quy trình tối ưu nhằm sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết
và phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt để phục vụ công tác giám định ADN hình sự.

5.6. Điện di và phân tích ADN thu được.
6. Những đóng góp của đề tài:
6.1. Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng bộ kit PrepFiler® trong tách chiết
ADN nhân tế bào từ hài cốt.
6.2. Đưa ra được quy trình tối ưu sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết và
phân tích ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định ADN từ hài cốt nói
riêng và giám định ADN hình sự nói chung. Từ đó ứng dụng vào thực tế phân tích
ADN hài cốt trong các vụ án hình sự.
6.3. Đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các
giải pháp thu thập và bảo quản những mẫu hài cốt để có khả năng phân tích được ADN
tốt nhất.

8


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giám định ADN từ nhân tế bào trong Khoa học hình sự
1.1.1. Lịch sử giám định ADN trong khoa học hình sự
Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong
nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể được xếp thành 23 cặp tương
đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. Riêng tế bào
trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái nhận từ
mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế
bào tinh trùng. Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc
thể trong tế bào thường là 46. Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này
sang thế hệ khác. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận

nhân gen PCR. Phản ứng PCR có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng
kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lượng rất ít ADN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ
phản ứng đã tạo ra được hàng triệu bản sao giống hệt nhau giúp cho việc phân tích
trình tự ADN được dễ dàng.
Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là
phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR) có gắn chất huỳnh quang hay
còn gọi là Microsatellite. Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 bp.
Năm 1997, trên thế giới đã đưa ra thông báo rằng có thể phân tích được ADN từ
các vi vết trên các đồ vật đã được tiếp xúc với cơ thể con người. Từ đó mở ra cơ hội
thu thập vi vết ADN từ nhiều loại vật chứng hơn (bao gồm: các công cụ, quần áo,
phương tiện, súng, bao cao su, son môi, ví tiền, trang sức, kính, da, giấy tờ, bàn chải
đánh răng).
1.1.2. Giám định ADN
Bằng việc sử dụng bộ kit Identifiler , Identifiler Plus và Identifiler Direct , cùng
hệ thống máy móc đồng bộ của hãng ABI

– Mỹ để phân tích 16 locus (gen) của các

phân tử ADN nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, các locus này có tính đặc trưng
và sự đa hình cao ở người Việt Nam. Đây là bộ kit được dùng phổ biến nhất và là bộ
kit chuẩn CODIS (Hệ thống chỉ số kết hợp ADN) của FBI, Mỹ gồm 15 locus STR trên
nhiễm sắc thể thường và 1 marker giới tính. Ưu điểm của bộ kit này là độ nhạy cao, tín
hiệu phân tích rõ nét và được sử dụng phổ biến nhất thế giới hiện nay (chiếm khoảng
80%) trong việc giám định ADN, xây dựng tàng thư ADN và xác định huyết thống. Ở

10


Luận văn thạc sỹ khoa học


Mỗi nhóm locus được biểu diễn bằng một màu sắc khác nhau, cụ thể:
-

Màu xanh da trời (blue): D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO.

-

Màu xanh lá cây (green): D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338.

11


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

-

Màu vàng (yellow) (trên hình biểu diễn bằng màu đen): D19S433, vWA,
TP0X, D18S51.

-

Màu đỏ (red): Amelogenin (giới tính), D5S818, FGA.

Hình 1.1. Hình ảnh phân tích kết quả điện di bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.2
* Nguyên tắ c so sánh và truy nguyên cá thể dựa vào hệ Identifiler:
Kiể u gen của mỗi người sẽ đươ ̣c thố ng kê và so sánh với nhau ở từng locus

.


10; 12

D21S11

30; 32.2

30; 31

30; 31

D7S820

11; 13

11

12; 14

CSF1PO

11; 12

11; 12

10; 12

D3S1358

15; 17


19; 24

18; 20

D19S433

14

13; 14

12; 14

vWA

17

15; 17

15; 17

TPOX

8; 11

8; 11

9

D18S51


AMEL

13


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Từ bảng 1.1:
Người có mẫu ký hiê ̣u ―Bố ‖ và người có mẫu ký hiê ̣u ―Con 1‖ có cho nhâ ̣n alen
ở tất cả các locus gen kể trên . Ngƣời có mẫu ký hiêụ “Bố ” là cha đẻ của ngƣời có
mẫu ký hiêụ “Con 1”.
Người có mẫu ký hiê ̣u ―Bố ‖ và người có mẫu ký hiê ̣u ―Con 2‖ không cho nhâ ̣n
alen ở 03 locus gen (D7S820, D16S539, D2S1338). Ngƣời có mẫu ký hiêụ “Bố ” không
phải là cha đẻ của ngƣời có mẫu ký hiệu “Con 2”.
1.2. Các kỹ thuật tách chiết ADN
1.2.1. Phương pháp tách chiết hữu cơ (phương pháp tách chiết bằng phenol/
chloroform/ Isoamyl Alcohol)
Phương pháp này chủ yếu dựa trên nguyên lý độ hòa tan khác nhau của protein
và axit nucleic trong các dung môi khác nhau. Sử dụng hỗn hợp sodium dodecyl
sulphat (SDS) và proteinase K để phá màng tế bào và màng nhân, sau đó loại bỏ các
thành phần không mong muốn trong mẫu bằng hỗn hợp phenol/chloroform/izoamyl
alcohol (biến tính protein nhưng không hòa tan axit nucleic). Cuối cùng thu lấy ADN
bằng cách tủa trong ethanol hoặc izopropanol.
Phương pháp tách chiết hữu cơ có ưu điểm là tách được lượng lớn ADN, có độ
tinh sạch cao. Tuy nhiên phương pháp này phải sử dụng hóa chất độc hại và tiến hành
nhiều thao tác nên mẫu dễ bị tạp nhiễm.
1.2.2. Phương pháp tách chiết bằng chelex

và quá trình ly giải.
Bƣớc 2: Gắn ADN hoặc ARN vào cột sắc ký
Ngoài các muối chaotropic, cồn cũng được sử dụng để tăng khả năng gắn của
acid nucleic vào silic, thường dùng là ethanol hoặc đôi khi là isopropanol. Việc tối ưu
hóa lượng ethanol để tăng hiệu suất tách chiết acid nucleic cũng là vấn đề cần quan
tâm. Quá nhiều ethanol sẽ làm ADN bị đứt gãy thành nhiều đoạn nhỏ ảnh hưởng đến
khả năng đọc UV ở bước sóng 260nm, ngược lại quá ít ethanol sẽ gây khó khăn cho
bước rửa muối trên màng.

15


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Bƣớc 3: Rửa ADN (hoặc ARN)
Đây là bước cần thiết để loại bỏ các thành phần còn sót lại trên màng như
protein, polysaccharide hay thậm chí là chất màu nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh
sạch ADN hoặc ARN cao. Muối còn sót lại làm giảm quá trình rửa giải acid nucleic
đưa đến kết quả đọc UV ở bước sóng A230 cao và tỷ lệ UV 260/230 thấp. Vì thế, một
vài bộ kit thực hiện bước rửa bằng ethanol tới 2 lần.
Bƣớc 4: Loại ethanol bằng cách làm khô
Thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. Nếu cột lọc vẫn còn sót lại
ethanol, nucleic acid không thể bị hydrate hóa đầy đủ dẫn tới hiệu suất tách chiết ADN
thấp.
Bƣớc 5: Rửa giải ADN hoặc ARN đƣợc gắn vào cột
Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh
trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng
làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa

tách ra khỏi hạt từ tính.
1.2.4.3. Quy trình thực hiê ̣n của bộ kit PrepFiler®
Bƣớc 1. Xác định lƣợng mẫu sử dụng
Sử dụng 40µl đối với mẫu dịch (máu, nước bọt) và 25 mm2 đối với vật mang
(giấy, vải..) cho 1 lần tách chiết ADN.

17


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

Bƣớc 2. Ủ mẫu với Lysis Buffer
Mẫu được chuyển vào ống Eppendoft 1,5 ml, bổ sung 300 µl PrepFiler Lysis
Buffer, 3 µl DTT 1,0 M.
Tuýp mẫu được đưa vào máy lắc nhiệt, ủ ở 56oC với tốc độ 900 rpm trong một
thời gian (từ 20 phút đến 90 phút tùy loại mẫu).
Bƣớc 3. Loại bỏ cơ chất
Tuýp mẫu được đưa về nhiệt độ phòng và ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sau
đó được hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang ống Eppendoft 1,5 ml khác.
Bƣớc 4. Gắn ADN với các hạt từ tính (Magnetic Particles)
Tuýp PrepFiler Magnetic Particles được lắc trong 5 giây và lật ngược để có thể
chắc chắn rằng không có hạt từ còn lại ở đáy tuýp. Hút 15 µl hạt từ tính bổ sung vào
tuýp chứa dịch mẫu và lắc ở tốc độ chậm 500 đến 1200 vòng/phút trong 10 giây, sau
đó ly tâm trong vài giây.
Tuýp chứa dịch mẫu được thêm 180 µl Isopropanol và lắc ở nhiệt độ phòng
trong 10 phút, tốc độ 1000 rpm.
Bƣớc 5. Rửa ADN liên kết với hạt từ
Ống Eppendoft được lấy ra khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để đảm bảo không còn

Trong phôi thai, xương được hình thành từ lớp trung phôi bì và phát triển qua 3
giai đoạn: màng => sụn => xương (trừ một số xương ở vòm sọ, một vài xương mặt
không qua giai đoạn sụn và một phần xương sườn vẫn tồn tại sụn, không qua giai đoạn
xương).
Bộ xương màng ở người bắt đầu hình thành từ cuối tháng một của bào thai. Từ
tháng thứ hai thì màng biến thành sụn, và từ cuối tháng thứ hai thì sụn bắt đầu được
thay bằng mô xương. Sau khi ra đời, quá trình hóa xương vẫn tiếp tục cho tới lúc
trưởng thành (nam khoảng 25 tuổi, nữ khoảng 23 tuổi).
Tuổi thiếu niên, sự hóa xương chưa hoàn tất, sụn vẫn còn nhiều. Đặc biệt các
đốt sống vẫn chưa cốt hóa hết, đĩa sụn gian đốt sống vẫn còn mềm.

19


Luận văn thạc sỹ khoa học

Lê Xuân Toàn

1.3.1.2. Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của xương [11]
Trong xương có 2 thành phần chủ yếu:
- Thành phần hữu cơ: chiếm 30% gồm prôtêin, lipit, mucopolysaccarit.
- Chất vô cơ: chiếm 70% gồm nước và muối khoáng, chủ yếu là CaCO3,
Ca3(PO4)2. Các thành phần hữu cơ và vô cơ liên kết phụ thuộc lẫn nhau đảm bảo cho
xương có đặc tính đàn hồi và rắn chắc. Nhờ đó xương có thể chống lại các lực cơ học
tác động vào cơ thể. Xương người lớn chịu được áp lực 15kg/mm2, gấp khoảng 30 lần
so với gạch, hoặc tương đương với độ cứng của bê tông cốt sắt.
- Tỉ lệ các thành phần hóa học của xương ở mỗi người không hoàn toàn giống
nhau. Tỉ lệ đó phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, tuổi tác, bệnh lý. Cơ thể càng non,
chất hữu cơ trong xương càng nhiều nên xương trẻ em mềm dẻo hơn. Khi về già, tỉ lệ
vô cơ tăng dần lên nên xương giòn, dễ gãy.

xương bướm, xương sàng, xương hàm trên… là những xương dẹt nhưng trong khoang
xương lại không chứa tủy đỏ mà chứa khí. Đây là một đặc điểm thích nghi của bộ
xương người.
1.3.2. Phân tích ADN từ xương người
1.3.2.1. Cơ sở khoa học để có thể phân tích ADN từ xương người
Giống như các bộ phận khác trên cơ thể, trong xương có những tế bào sống
mang đầy đủ ADN, làm nhiệm vụ liên kết, nuôi dưỡng và duy trì cấu trúc xương. Đặc
biệt ở các xương dài, xương cột sống và răng còn có tủy sống chứa một lượng lớn tế
bào, đủ để có thể tiến hành phân tích ADN.
1.3.2.2. Các xương được ưu tiên trong phân tích ADN
Theo nghiên cứu của tiế n si ̃ Timothy McMahon khi phân tích 5946 mẫu hài cố t
có thời gian trên 50 năm thì kế t quả phân tić h ADN ty thể ta ̣i các vi ̣trí khác

nhau củ a

bô ̣ xương đươ ̣c thể hiê ̣n trong Hình 1.3. Theo đó sẽ lựa cho ̣n phầ n xương để tiế n hành
thí nghiệm theo tiêu chí:
-

Phầ n xương tố t nhấ t cho viê ̣c phân tích ADN: xương đùi.

-

Phầ n dễ thu thâ ̣p nhấ t: răng (răng hàm ).

21