Bộ Công Thương
Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm
Khoa Cơng Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Mơi Trường

BÀI TIỂU LUẬN
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ
KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai
Danh sách thành viên :
Nguyễn Tuấn Ngọc
2013100090
Lê Hồ Thảo Nguyên 2008100132
Huỳnh Ngọc Tuyền
2008100168
Lê Thò Thúy Hằng
2008100110
Tháng 12 -2011

MỤC LỤC


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
2
II. NỘI DUNG
1.
Khái quát về Streptomyces orientalis
3
1.1. Streptomyces 3
1.2. Streptomyces orientalis
3

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành
công nghệ hàng đầu của thế giới. Và trong đó, công nghệ sinh học vi
sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các loại hoạt chất ứng dụng
2


trong y học cũng như những lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống và
nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc.
Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công
nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan
trọng của mình. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì
có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn có khoảng 8.000 chất là
do kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn
60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một
chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa
dạng về cấu trúc trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt trong số đó
có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều
ứng dụng trong thực tiễn đời sống hiện nay.
Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế những
nhà khoa học cũng như những y bác sĩ không ngừng học hỏi tìm tòi để
có thể tìm được ra những phương thức mới để kháng bệnh, và trong
đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN
TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán bộ
thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được nhóm tâm đắc nhất
và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp ở đề
tài này.
+ Mục tiêu :
Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh
vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 ph hợp

loài
Streptomyces vi khuẩn đã được mô tả. Cũng như
với các Actinobacteria khác, Streptomyces là
Gram dương, và có bộ gen với cao GC . được
tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục
HHnh 1.1
nát, nhất Streptomyces sản xuất bào tử, và được
Streptomyces
ghi nhận về mùi của họ mà kết quả từ sản xuất
của một biến động chất chuyển hóa, geosmin.
Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều
nhất là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces). Streptomyces thường sống
ở đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng.
Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và
đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.
1.2 Streptomyces orientalis
Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là Streptomyces
orientalis , nay được gọi là orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn
Streptomyces chủ yếu được tìm thấy trong đất và thảm thực vật mục
nát . Streptomyces orientalis ban đầu được tìm thấy trong đất Ấn Độ
và Indonesia. Nó được phát triển trên môi trường thạch men một chiết
xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C.
Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, được
sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi
khuẩn Gram dương, đặc biệt là khuẩn tụ cầu. Nó hoạt động bằng cách
ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Trong khi
4


Vancomycin có thể hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, nó cũng có thể


2. Khái quát về Vancomycin
Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm
glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị
bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng
vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm
H nh 1.2 do các chủng vi sinh vật kháng
trùng nguyHhiểm
HHnh 1.3
methicillin (chất kháng sinh nhiễm -lactam) gây
nên. Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ
hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi
HHnh 2.1
là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh
cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các
kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng
sinh thông dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin
vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng
sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao. Hơn nữa nghiên cứu lên men
vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn
tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở
quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện
mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế
đề ra.
Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản
xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phối hợp với điều
kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng
với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này
với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức
khỏe cộng đồng.

kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt từng
lĩnh vực. CEPA mã hóa cho mô-đun 1, 2, và 3. CepB mã hóa cho các
mơ-đun 4, 5, và 6. và CepC mã hóa cho mơ-đun 7. Sau khi phân tử
heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin đã phải trải qua
thay đổi hơn nữa, chẳng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl
hóa. Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open
reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 được sử dụng.
Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là những enzym P450 . Và ORF 9 và 14
được xác định là enzym thủy phân giả định. Với sự gíup đỡ của các
enzym này, các nhóm -hydroxyl được giới thiệu trên tyrosine dư
lượng 2 và 6, và khớp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và
vòng 4 và 2. Ngồi ra, haloperoxidase được sử dụng để gắn các nguyên
tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một quá trình oxy hóa.
7


HHnh 2.2

2.2 Dược và hóa học
Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal
glycosyl hóa được sản xuất bởi quá trình lên men của các loài
actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước đây là chỉ định
Nocardia orientalis ).
8


Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác
biệt rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết. Các hình thái
hiện diện trong thuốc là các mặt nhiệt động ổn định hơn conformer và
do đó có hoạt động mạnh hơn.

chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H,
TH447, A12, A-9, 48.

HHnh 3.1

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912
A. Hình dạng khuẩn lạc, B. Cuống sinh bào tử, C. bào tử.
3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh
của chủng S. orientalis 4912
Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong
lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis
4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường
MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở
để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên
men đến khả năng tạo kháng sinh.

HHnh 3.2

10


Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912
Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với
hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số
các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh
cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng
của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát
triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 là
280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên
men thích hợp 6 - 8% so với môi trường lên men.

80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S. orientalis 491281-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao
nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên
men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866
mcg/ml).
3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin
của chủng đột biến
Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis
4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương
pháp quy hoạch thực nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột
đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/l;
CuSO4 10 mg/l.
Ảnh hưởng của của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ
tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích
hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong
môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomycin, các thí
nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được thực hiện
trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt
độ và tỉ lệ giống được xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô
và hoạt tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được
duy trì ở mức 20-30% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao
nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml. Như vậy, kết quả
của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo
đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản
xuất vancomycin.
Để
xác
định thời điểm
thu
hồi



Kiểm tra
vancomycin bằng
Phỏ UV của
sắc ký lớp mỏng
vancomycin
1. Vancomycin từ
Phỏ
HPLC
của
chuẩn (trên) và
môi trường nuôi
vancomycin chuẩn (trên)
vancomycin
cấy 2. Vancomycin
và vancomycin chủng S.
chủng
S.
được tách chiết và
orientalis 4912 (dưới)
orientalis 4912
làm tinh khiết; và
(dưới)
3. Vancomycin
chuẩn (Merck)
4. Một số ứng dụng khác của Streptomyces
4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng
trừ nấm gây bệnh thực vật
Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng

số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh
đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật.
4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên thành
sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh
bào tử có nhiều dạng khác nhau tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có
móc, vòng….

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp :
phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng
trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể
nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. Tuỳ thuộc vào lõi xạ khuẩn với môi
trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì bào
tử thể hiện đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí
cũng rất khác nhau tuỳ theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có
thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi
khuẩn gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu
15


thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển
ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS
ức chế vi khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật
nguyên sinh.
4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra các
protein dị để sản xuất dược sinh học
Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh hoặc chẩn đoán vi


chất P hữu cơ thành muối của H3PO4 được thực hiện bởi nhóm vi
sinh vật phân huỷ P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau :
Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4
Vi sinh vật phân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillu và
Pseudomonas.
Các loài có khả năng phân giải mạnh là : B.megaterium, Serratia,
B.subtilis, Serratia,
Proteus, Arthrobster, ...
 Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter,
Agrobacterium.
 Xạ khuẩn: Streptomyces...
III. Kết luận
Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng
để chữa các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra,
đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin.
Kết quả nghiên cứu được xây dựng được quy trình thích hợp để sản
xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344%.
Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với
vancomycin chuẩn (Merck).
Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc
điểm giống loại S.orientales như chủng chuẩn ISP 504 được mô tả, sử
dụng hầu hết các nguồn đường, sinh trưởng phát triển tốt, nhiệt độ
sinh trưởng tối ưu ở 28-300C, pH thích hợp cho sự phát triển của
chủng này từ 6 đến 9, chịu muối đến 6% và không có khả năng tạo
xenlulaza.
Chủng S. orientalis 4912 cĩ hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi
Streptomyces orientalis Pittenger & Brigham, ức chế được cả vi
khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường cơ sở

TÀI LIỆU THAM KHẢO
(1) http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces
(2) http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html
(3) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html
(4) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html
(5) http://www.businesschemistry.org/article/?article=82
(6) www.en.wikipedia.org/wiki/Vancomycin
(7)
www.dspace.isivast.org.vn/dspace/bitstream/123456789/3266/1/dt1.d
oc
(8) www.scribd.com/doc/35890819/STREPTOMYCES
18


Tạp chí công nghệ sinh học

19