TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THIỆN NAM

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN
CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THIỆN NAM

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN
CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TỪ THANH DUNG

2010

3.2.3. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu....................................16
Phần 4: Kết quả............................................................................................17
4.1. Kết quả kháng sinh đồ.......................................................................17
4.2. Kết quả MIC......................................................................................17
4.3. Hiện tượng đa kháng.........................................................................18
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn E. ictaluri ..........19
Phần 5: Thảo luận........................................................................................21
Phần 6: Kết luận và đề xuất ........................................................................24
Tài liệu tham khảo.......................................................................................25
Phụ lục.........................................................................................................29

i


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình...17
Bảng 4.2: Giá trị MIC của 40 chủng vi khuẩn E. ictaluri................................18
Bảng 4.3: Một số kiểu hình đa kháng của các chủng vi khuẩn E. ictaluri......19
Bảng 4.4: Tần số tiếp hợp của 7 chủng E. ictaluri với E. coli RC85...............20

ii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1: Kết quả MIC của oxytetracycline đối với chủng E. ictaluri ...........18
Hình 4.2: Tỉ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh.................19
Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli RC85 sau khi tiếp hợp...........................................20

iii


Những năm vừa qua, nghề nuôi thủy sản tại Việt Nam đã có bước phát
triển đáng kể. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng sản xuất thủy sản chính của
Việt Nam, cung cấp hơn 80% tổng sản phẩm thủy sản cả nước và cá tra đã trở
thành đối tượng nuôi phổ biến, đem lại lợi nhuận cao. Tính trong tháng
8/2009, sản phẩm xuất khẩu của cá tra và basa vào thị trường EU đã tăng
2,42% về giá trị và 8,75% về lượng. Tính chung 7 tháng đầu năm 2009 sản
lượng nuôi trồng đạt 1401,9 nghìn tấn, tăng 1,6% (www.gso.gov.vn). Tuy trong
năm 2009, nghề nuôi cá tra gặp nhiều khó khăn nhưng nhìn chung cá tra vẫn là
đối tượng nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh tế cao.
Trong nhiều năm qua, với hình thức nuôi công nghiệp mật độ cao,
người nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do nhiều dịch bệnh nguy hiểm phát sinh
như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù đầu,…(Từ Thanh Dung và ctv,
2004). Trong số các bệnh này thì bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri gây ra là rất phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi.
Theo Crumlish et al. (2006), tại tỉnh An Giang có đến 55% số hộ nuôi có cá
tra bị nhiễm bệnh gan thận mủ với tỉ lệ hao hụt lên tới 60% (trích dẫn bởi Tiết
Ngọc Trân, 2007). Theo điều tra của Châu Hồng Thúy (2008), tại Trà Vinh có
đến 96% ao nuôi cá tra thâm canh bị bệnh gan thận mủ. Bệnh nghiêm trọng
này được phát hiện ngày càng nhiều hơn trong toàn bộ quá trình nuôi và hiện
diện ở tất cả các lứa tuổi của cá. Chúng làm gia tăng tỉ lệ hao hụt ở cá và chi
phí cho việc điều trị.
Cho đến nay, kháng sinh vẫn là biện pháp chữa trị hiệu quả nhất cho
những bệnh do vi khuẩn này. Nhiều loại kháng sinh đã được sử dụng 1 cách
rộng rãi, phổ biến trong nuôi thủy sản tại Việt Nam. Trong đa số các trường
hợp, lượng thuốc kháng sinh được sử dụng chỉ là ước lượng, không đúng liều
và trong thời gian dài. Và khi dùng kháng sinh trong thời gian dài, với liều
thấp như vậy sẽ làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh,
làm cho công tác trị bệnh trở nên khó khăn, tốn kém hơn. Sự kháng thuốc
kháng sinh gián tiếp trong vi sinh vật có thể được hình thành thông qua các
gen nhiễm sắc thể hoặc thông qua plasmid (Prescott et al., 2000). Theo Bùi

được dùng phổ biến hiện nay lên vi khuẩn này.
• Thực hiện tiếp hợp vi khuẩn để xác định tần suất truyền gen kháng
thuốc của vi khuẩn E. ictaluri kháng thuốc cho vi khuẩn E. coli.

2


Phần 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.1.1. Đặc tính của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Theo Inglis et al. (1993), giống vi khuẩn Edwardsiella được ghi nhận
đầu tiên vào năm 1962 bởi Sanazaki và được mô tả bởi Ewing et al. (1965).
Giống này có 2 loài gây bệnh trên cá là: Edwardsiella tarda và Edwardsiella
ictaluri. Loài E. ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke (1979). Loài vi khuẩn
này được biết đến là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (ESC) trên cá
nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), tỉ lệ hao hụt khoảng 10% – 50%. Đến năm
2001 và 2004 các tác giả Ferguson và Từ Thanh Dung đã nghiên cứu và kết
luận loài vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh gan thận mủ trên cá
tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi tại Việt Nam.
Theo Inglis et al. (1993), loài E. ictaluri là vi khuẩn Gram âm, hình
que, di động yếu ở 25oC – 30oC, phát triển chậm, trong 36 – 48 giờ trên môi
trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 28oC – 30oC, tạo thành những
khuẩn lạc nhỏ và phát triển rất kém hoặc không phát triển ở 37 oC. Không hiện
diện ở độ mặn lớn hơn 1,5%.
Theo Shotts và Waltman (1990) thì môi trường chọn lọc thích hợp cho
vi khuẩn E. ictaluri là E. ictaluri medium (EIM) rất thích hợp cho việc chọn
lọc vi khuẩn này. EIM ức chế sự phát triển của đa số vi khuẩn Gram âm, Gram
dương và cả nấm. Trên môi trường EIM, E. ictaluri cho các khuẩn lạc màu
xanh mờ, kích thước 0.5 – 1 mm sau 48 giờ ở 30oC.


Edwardsiella
ictaluri
Methyl red
+
Voges – Proskauer
Gelatin hydrolysis
Gas from glucose
+
Acid from: arabinose
glucose
+
inositol
mannitol
rhamnose
sorbitol
-

Một số nghiên cứu sau này cũng cho thấy thời gian tốt cho sự phát triển
của vi khuẩn E. ictaluri là 24 giờ ở 28oC. Sự nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá
tra giống cho tỉ lệ hao hụt cao ở 24 oC và 28oC, ở 32oC cho tỉ lệ thấp. (Trần Lê
Triệu Tú, 2007). Bên cạnh đó, dòng E. ictaluri ở cá nheo Mỹ có khả năng xâm
nhập cao và số lượng lớn hơn dòng E. ictaluri ở cá tra. Lượng vi khuẩn của cả
2 dòng xâm nhập sau 1 giờ là cao nhất so với các thời điểm khác, khoảng 10 4105 CFU/g (Tiết Ngọc Trân, 2007)
2.1.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Các nghiên cứu cho thấy E. ictaluri còn gây bệnh trên các loài cá như:
blue catfish (I. furcatus), white catfish (I. melas), và 2 loài cá cảnh ở Mỹ
(Waltman et al., 1985), walking catfish (Clarias batrachus) tại Thái Lan
(Kasornchandra et al., 1987) (trích dẫn bởi Inglis et al., 1993).
Các tác giả: Speyerer và Boyle (1987), Newton et al. (1988) cho biết có

2.2.1. Những hiểu biết về thuốc kháng sinh
Cho đến nay thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một cách phổ biến để
phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Thuốc kháng sinh là hợp
chất được sản xuất bởi sinh vật hay tổng hợp, ở nồng độ thấp thì có thể ức chế
hoặc giết các sinh vật khác. Thuốc kháng sinh được Fleming phát hiện đầu
tiên là penicillin vào năm 1929. Những năm sau thuốc kháng sinh khác được
sản xuất từ vi sinh vật hoặc tổng hợp hay bán tổng hợp. Với những tác dụng
hữu hiệu của các thuốc kháng sinh đối với mầm bệnh nên chúng được dùng
rộng rãi trong việc điều trị bệnh cho người, vật nuôi nói chung ở cả động vật
thủy sản (Prescott et al., 2000).
Theo điều tra của Nguyễn Chính (2005), chỉ riêng tại An Giang và Cần
Thơ đã có đến 113 sẩn phẩm thuốc kháng sinh lưu hành trên thị trường phối
chế từ 32 loại chất kháng sinh khác nhau. Phổ biến nhất là: ciprofloxacin,
enrofloxacin, oxolinic acid, flumequine, norfloxacin, ofloxacin, quinolon.
Tại Trà Vinh, để điều trị bệnh gan thận mủ do E. ictaluri gây ra, người
nuôi sử dụng phổ biến nhất là các chất kháng sinh: florphenicol, enrofloxacin,
norfloxacin (68,75%). (Châu Hồng Thúy, 2008)
Nhiều sản phẩm thuốc kháng sinh khuyến cáo trộn với liều thấp vào
thức ăn để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Ngoài ra có đến 16% sản
phẩm phối trộn trên 3 loại thuốc kháng sinh (Nguyễn Chính, 2005). Việc sử
dụng kháng sinh để trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản không theo qui định sẽ

5


tạo điều kiện thuận lợi hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh, dẫn đến
những tác hại nghiêm trọng cho động vật nuôi và cả con người.
2.2.2. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh
2.2.2.1. Khái quát về hiện tượng kháng thuốc
Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên

6


Theo Bùi Kim Tùng (2001) thì kháng thuốc do plasmid không bền.
Loại này qua vài thế hệ, plasmid có thể biến mất và đề kháng không còn. Bên
cạnh đó, còn có dạng kháng thuốc chai lì, ở đây các khuẩn này chịu đựng được
tác dụng của kháng sinh mà không bị tiêu diệt. chúng sống trong tình trạng trì
trệ, khi gặp thuận lợi lại tiếp tục phát triển và thế hệ sau vẫn nhạy cảm với
thuốc. Theo tác giả, chính do việc dùng thuốc với liều khởi đầu thấp rồi tăng
dần, dẫn đến vi khuẩn thích ứng với thuốc và tồn tại dưới dạng chai lì. Vì thế
nên dùng liều khởi đầu khá cao để nhanh đạt hữu hiệu. Ngoài ra cần xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các kháng sinh tạo đề kháng nhanh.
Khi dùng kháng sinh ở nồng độ thấp kéo dài sẽ tạo các chủng vi khuẩn
kháng thuốc. Ngoài ra, khi dùng ở nồng độ thấp hơn nồng độ ức chế tối thiểu
của kháng sinh đó thì có thể kích thích vi khuẩn gây bệnh phát triển. (TrevesBrown, 2000)
 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Theo Bùi Kim Tùng (2001) ở vi khuẩn có thể hình thành các cơ chế
như sau để chống lại tác động của thuốc kháng sinh:
• Tiết enzym phân hủy thuốc: VD: nhiều vi khuẩn tiết ra β-lactamase
phân hủy kháng sinh nhóm β-lactam.
• Giảm hấp thụ kháng sinh: màng tế bào thay đổi tính thấm chọn lọc
và thuốc kháng sinh không thể vào trong tế bào. (VD: các khuẩn
kháng tetracycline, aminosid)
• Thay đổi điểm tác dụng: thay đổi các thụ thể trên ribosom mà kháng
sinh gắn vào  kháng sinh vô hiệu. (VD: các khuẩn kháng
aminosid)
• Đổi quy trình tổng hợp: các vi khuẩn thay đổi quy trình tổng hợp vỏ
tế bào, hay các quy trình khác  kháng sinh vô hiệu (vi khuẩn
kháng với penicillin).
• Sản xuất chất cạnh tranh với kháng sinh: có những vi khuẩn tiết ra

Tại An Giang, vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra có hiện tượng
kháng với oxolinic acid trong khi đó vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc
tỉnh Cần Thơ thì lại cho kết quả kháng với oxytetracyclinee và sulphonamid.
(Crumlish et al., 2002)
Đến năm 2004, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra ở Cần Thơ và
Đồng Tháp đã kháng thêm oxolinic acid. Ngoài ra kết quả kiểm tra độ nhạy
với kháng sinh của 123 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường đã kháng với
chloramphenicol (30µg) (100%), kháng với tetracycline (30 µg) (90%),
trimethoprim/sulfadiazine (25 µg) (89%), ampicillin (10 µg) (76%) và
nitrofurantoin (300 µg) (65%). Trong khi chỉ 33% chủng được kiểm tra là
kháng với norfloxacin (10 µg). (Nguyễn Thanh Phương et al., 2004).
Theo nghiên cứu của tác giả Từ Thanh Dung và ctv (2004), cũng cho
biết vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang, Cần Thơ, Đồng
Tháp, Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracycline, oxolinic acid và
sulphonamid. Đến năm 2008, tác giả này tiếp tục nghiên cứu trên 64 chủng vi
khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh ở An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp,
8


qua kết quả MIC cho thấy: đa số vi khuẩn kháng với streptomycin (83%),
oxytetracycline (81%), trimethoprim (71%), flumequine (8%), oxolinic acid
(6%) và enrofloxacin (5%). Điểm nổi bật trong nghiên cứu này là đã xác định
có trên 73% chủng vi khuẩn E. ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít
nhất với 3 loại thuốc). Những chủng vi khuẩn này khi gây bệnh sẽ gặp nhiều
khó khăn trong điều trị. Đặc biệt, hầu hết các chủng vi khuẩn E. ictaluri thể
hiện sự kháng thuốc tự nhiên với colistin (100%) với giá trị MIC ≥ 128 µg/ml.
Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaliri với florfenicol là ≥ 2 µg/ml, cho thấy dòng
vi khuẩn này đã giảm tính nhạy với thuốc flofenicol, so với nghiên cứu của
Shu-Peng Ho et al. (2000) giá trị MIC của chủng vi khuẩn Edwardsiella phân
lập từ các loài cá bệnh ở Đài Loan với florfenicol chỉ ở mức 0,78 µg/ml.

đồ trên các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra cho thấy chúng đã
giảm tính nhạy với: tetracycline, ampicillin, amoxicillin, cephazolin,
flumequine, norfloxacin, riêng doxycycline tính nhạy tương đối cao. Qua giá
trị MIC cho thấy hầu hết các vi khuẩn kháng với oxytetracycline, giảm tính
nhạy với enrofloxacin, florfenicol. (Châu Hồng Thúy, 2008)
Những ảnh hưởng của các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh có nguồn
gốc từ vật nuôi lên sức khỏe của con người là đề tài muôn thuở, đang được
tranh cãi gay gắt. Vi khuẩn kháng thuốc từ động vật chẳng hạn như E. coli có
thể lây nhiễm cho con người, khả năng ảnh hưởng của nhóm
Enterobacteriacae là rất lớn. Vi khuẩn gây bệnh trên động vật tìm đến con
người bằng nhiều con đường khác nhau và trong các vi khuẩn này có thể gây
bệnh cho con người. Khi các vi khuẩn này đã kháng thuốc thì việc điều trị
bệnh cho con người trở nên khó khăn và phức tạp hơn. (Prescott et al., 2000)
2.2.2.3. Các nghiên cứu về plasmid gây kháng thuốc trên vi khuẩn E.
ictaluri
Qua kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả như trên cho thấy, sự kháng
thuốc kháng sinh hiện nay là rất phổ biến. Nguyên nhân các chủng vi khuẩn
trở nên kháng thuốc rộng rãi là do chúng có mang gen kháng kháng sinh từ vi
khuẩn khác thông qua plasmid. Những plasmid này thường mang gen kháng
thuốc kháng sinh. Hiện tượng truyền gen đa kháng thuốc đặc biệt nguy hiểm
khi chúng truyền gen này sang vi khuẩn gây bệnh ở người. Do đó, hiện tượng
truyền gen đa kháng thuốc kháng sinh bởi ADN plasmid được coi là vấn đề
lớn cần xem xét trong việc dùng thuốc kháng sinh điều trị bệnh vi khuẩn trong
nuôi trồng thủy sản.
Theo Nguyễn Lân Dũng (2007), plasmid là sợi ADN kép, dạng vòng
kín, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có khả năng sao chép độc lập với ADN của
nhiễm sắc thể. Các tính trạng độc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào
chủ ưu thế sinh trưởng, nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc.
Các plasmid gây kháng thuốc kháng sinh gọi là plasmid R. Một số
plasmid R cho tính kháng với 8 loại kháng sinh. Các plasmid R thường là tiếp

của kháng sinh. Do đó, khi môi trường ô nhiễm và có các mầm bệnh vi khuẩn
kháng thuốc kháng sinh, thực tế không chỉ đe dọa xảy ra tình trạng kháng
thuốc kháng sinh ở mầm bệnh của vật nuôi mà còn là nguồn có thể dễ dàng
truyền R plasmid kháng thuốc sang các mầm bệnh của các loài sinh vật khác,
kể cả mầm bệnh của người. Cụ thể là: sự chuyển gen của vi khuẩn A.
salmonicica subsp. salmonicica AL2027 cho vi khuẩn V. cholerae NVH4122
có tần suất là 2x10-5 (20oC, 24 giờ, không có tetracycline) (thông qua nước
biển), 3x10-5 (có tetracycline), giữa A. salmonicica subsp. salmonicica
AL2027 và E. coli DH5α gây bệnh ở người là 8x10-3. (Kruse and Sorum,
1994)
Tuy nhiên, đến năm 2003, khả năng tiếp hợp plasmid kháng
tetracyclines, trimethoprim và sulfonamides của vi khuẩn A. salmonicica
subsp. salmonicica 1995 và 2402 gây bệnh cá với vi khuẩn E. coli là khá cao.
Cụ thể là: E. coli DH5α nhận plasmid kháng thuốc của A. salmonicica subsp.
salmonicica 1995 và 2402 với tần suất lần lượt là 6,5x10 -3, 0,48 (môi trường
rắn, 24 giờ), 8,7x10-5, 1,1x10-3 (môi trường lỏng, 24 giờ). (Sorum et al., 2003)

11


Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về plasmid của vi khuẩn gây bệnh
trong thủy sản như nghiên cứu của Akinbowale et al (2006) phân lập plasmid
của 100 dòng vi khuẩn Gram âm được xác định là có 74,4% dòng vi khuẩn
mang 1-10 plasmid kháng thuốc kháng sinh có kích thước 2-51 kbp.
Việc phân lập plasmid của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản đã
được 1 vài nghiên cứu thực hiện. Tại Việt Nam, việc phân lập plasmid của
nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên cá và nhuyễn thể nước lợ đã được thực
hiện, kết quả cho thấy: 28 dòng Vibrio được nghiên cứu đều có chứa từ 2 – 12
plasmid với kích cỡ từ 2 – 140 kb (Đặng Thị Hoàng Oanh, 1991). Đối với
plasmid của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra, một nghiên cứu cho biết:

+ Vi khuẩn chuẩn Escherichia coli ATCC 25922, E. coli RC85.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp làm kháng sinh đồ
Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006.
Vi khuẩn sau khi được phục hồi và đã thuần thì kiểm tra kháng sinh đồ.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống
nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác
định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 625 nm với giá trị
OD = 0,08–0,13±0,02 thì mật độ vi khuẩn là 108 tế bào/ml.

13


Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn
lên môi trường thạch. Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi
khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch MHA. Sau đó dùng pel tiệt trùng
lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của
đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh
với rìa của đĩa petri là: 10-15 mm. Mỗi đĩa petri (Ø: 100 mm) môi trường đặt
tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm
ở điều kiện 28oC – 30oC. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô
trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),
2006 và dùng chủng chuẩn E. coli ATCC 25922 làm đối chứng, để xác định
loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng.
3.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
(Minimal Inhibitory Concentration – MIC)

Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào.
Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng
625 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHB Brain heart
broth (BHB, Merck, Darmstadt, Germany) (không dùng nước cất) ở điểm OD
= 0,08–0,13±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml), sau đó được pha
loãng về 105 CFU/ml , mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA
để kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC.
Cho 1 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 1 ml dung
dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5,…,1024 µg/ml (cần lắc đều).
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
+ Đối chứng âm: 1 ml BHB + 1 ml nước muối sinh lý
+ Đối chứng dương: 1 ml dung dịch vi khuẩn + 1 ml nước muối sinh lý
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 20-24 giờ. Riêng với vi
khuẩn đối chứng E. coli ATCC 25922 ủ ở 37oC.
 Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết
quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì
làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng
âm và dương.
Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh
mà ở đó không có vi khuẩn phát triển.
15


3.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn
Khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn được thực hiện theo phương
pháp của Sorum et al. (2003).



Phần 4
KẾT QUẢ
4.1. Kết quả kháng sinh đồ
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng vi khuẩn vẫn còn nhạy với
ampicillin (82,5%) và ciprofloxacin (72,5%). Đa số các chủng E. ictaluri đã
kháng với: norfloxacin (40%), tetracycline (60%), doxycycline (67,5%),
enrofloxacin, florfenicol (77,5%) và kháng rất cao với chloramphenicol,
streptomycin (95%), flumequine (87,5%) và trimethoprim+sulfamethoxazol
(80%). Độ nhạy của các chủng vi khuẩn E. ictaluri với các loại kháng sinh
được trình bày chi tiết trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình
STT

Kháng sinh

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Ampicillin

77,5
60
67,5
15
77,5
40
87,5
80

Nhạy
(%)
82,5
5
5
5
22,5
27,5
72,5
0
37,5
10
15

Nhạy TB
(%)
17,5
0
0
17,5
17,5

1 1 1 0 1 5 16 2
Enrofloxacin
0
0 4 7 6 4 9 1 4
Oxytetracycline 1
4 5 1 0 1 8 7 3
Streptomycin
0
0 0 0 2 4 0 0 19
Kháng sinh

256

Số chủng
MIC MIC
% kháng
kháng
50% 90%

1

10

25

16

32

13

ictaluri thể hiện tính đa kháng thuốc kháng sinh (kháng trên 3 loại kháng
sinh). Đặc biệt, vi khuẩn kháng với 6 – 10 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ khá cao,
trong đó 25% số chủng kháng với 8 loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng
kháng với 9 loại kháng sinh và có 10% số chủng kháng với 10 loại kháng sinh.

18