PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiều
ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm
nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy ra trong điều kiện
êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn
đối với con người và thiên nhiên.
Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái
tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp. Cụ thể: Đề tài
nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật
tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng
quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa
plasminogen”.
Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác dụng có thể
thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của
da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu
hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ
phẩm.
Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas,
Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết
peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên nguồn
gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một số loại vi
khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như Pseudomonasaeruginosa
gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái
tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn.
Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành công
nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng enzyme cần
thiết sẽ không đáp ứng đủ. Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ đó sản xuất
enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp phần quan trong trong
việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn.
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái

- Đưa ra các điều kiện để chế tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong xử lý phụ
phẩm chế biến cá da trơn.

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase
1.1. Gelatin
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn,
cá. Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40 oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ở

2


điều kiện bình thường có dạng sệt. Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân
Collagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O 
C102H151N31O39 (gelatin)
Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin thiết yếu
(Hình 1).

Hình 1. Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin
Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:
Bảng 1. Thành phần acid amin của gelatin
STT
Loại acid amin
Tỉ lệ (% )
1
Alanine
8.6 - 10.7
2

Methionin
0.8 - 0.92
13
Histidine
0.85 - 1.0
14
Phenylalanine
2.1 - 2.56
15
Proline
16.2 - 18.0
16
Serine
2.9 - 4.13
17
Threonine
2.2
18
Tyrosine
0.44 - 0.91
19
Valine
2.5 - 2.8 2,519
1.2. Gelatinase
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn và động
vật bậc cao. Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid

3


+
+
+
+
+
+
+
+
+

2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
2.1. Vi khuẩn Aeromonas hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích thước chiều
rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng không có khả năng hình
thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC).

4


Hình 3. Hình thái A. hydrophila
A. hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ trên cá.

Hình 4. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila
2.2. Vi khuẩn Pseudomonas
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn Gram
âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên mao) và không có
bào tử.


106

Da cá
Alaska
pollockb
108
358
55
95

Hakea
119
331
59
114

5. Biến nạp
6. Vector biểu hiện
6.1. Vector biểu hiện
6.2. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn E.coli
7. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

6

Megrima
123
350
60
115


 Môi trường LB lỏng
 Môi trường LB thạch
 Môi trường LB - Kháng sinh
1.2. Hóa chất
 Hóa chất tách plasmid từ tế bào vi khuẩn
 Hóa chất chạy điện di gel agarose
 Hóa chất tinh sạch ADN từ gel agarose
 Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE
1.3. Thiết bị

7

Kích thước gel
501 bp


2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp điện di trên gel agarose
2.2. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain
Reaction)
2.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
2.4. Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm
2.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
2.6. Phương pháp nối gen
2.7. Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ
2.8. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli
2.9. Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
2.10. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
2.11. Phương pháp điện di gel SDS-PAGE
2.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase


1

Sbjct

1

Query

61

Sbjct

61

Query

121

Sbjct

121

Query

181

Sbjct

181


415

Query

481

Sbjct

475

Query

541

Sbjct

535

GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT

60

ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT

120


420

TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC

480

GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA

540

ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA
+

60

120

180

240

300


Hình 1.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme BamHI và XhoI
M: thang chuẩn 10kb; 1: Sản phẩm PCR gen GelE; 2: sản phẩm cắt pET 32a+/ GelE
với enzyme BamHI và XhoI

10


Kết quả điện di cho thấy: các enzyme giới hạn đã cắt plasmid thành hai băng có kích
thước tương ứng với kích thước của gen GelE/A và vector pET 32a +. Như vậy có thể kết
luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a+-GelE/A.
1.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ
Kết quả nuôi cấy vi khuẩn được thể hiện ở hình 1.5.

Hình 1.5. Kết quả biến nạp vector pET 32a+/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3)
và nuôi trên môi trường LBAmp
Sự biểu hiện protein GelE trong E coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng
phương pháp SDS-PAGE.

Hình 1.6. Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE
(M: thang chuẩn; giếng 1: E.coli BL21- pET32a+/GelE không cảm ứng với IPTG; giếng 23: E.coli BL21- pET32+/GelE cảm ứng với IPTG; giếng 4: E.coli BL21- pET32+).
So sánh giữa hình ảnh điện di đồ của các mẫu có và không có chất cảm ứng IPTG,
đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy: các mẫu có cảm ứng với IPTG
(đường chạy số 2-3) xuất hiện một băng protein mới có kích thước nằm ở khoảng giữa 72
kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết của protein gelatinase có gắn đuôi His-tag) còn ở
mẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1) không thấy xuất hiện băng này. Hơn nữa,
ở mẫu nuôi E.coli BL21- pET 32a+ cũng không bổ sung IPTG (đường chạy số 4) không
thấy xuất hiện băng protein trên. Như vậy, băng protein xuất hiện mới này khả năng lớn
chính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện.


Kết quả biến nạp được thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21
Chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE được nuôi cấy ở các điều kiện pH = 7, thời gian
tăng sinh 3 giờ, nhiệt độ tăng sinh 370C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 µg/ml, nồng
độ IPTG cảm ứng là 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM. Kết quả thí nghiệm được kiểm
tra bằng điện di SDS – PAGE, thể hiện ở hình 2.2.

Hình 2.2. Mức độ biểu hiện protein GelE ở các nồng độ IPTG cảm ứng
M: thang protein chuẩn, 1-6: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E.coli BL21pET32a+/GelE được cảm ứng với các nồng độ IPTG là 6, 5, 4, 3, 2, 1mM, 7: không cảm
ứng IPTG
Kết quả điện di cho thấy, nồng độ IPTG từ 1-6mM đều cảm ứng sinh gelatinase.
Trên hình ảnh điện di đồ, cả 6 mẫu này đều xuất hiện vạch tương ứng với kích thước
72kDa, tương ứng với trọng lượng lý thuyết của enzyme gelatinase.
Dịch tăng sinh của chủng vi khuẩn biểu hiện được cảm ứng với IPTG và không cảm
ứng với IPTG được tách để định xác định hoạt tính gelatinase. Kết quả thí nghiệm được thể
hiện ở hình 2.3.

13


Hình 2.3. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nồng độ IPTG cảm ứng
Hình 2.3 cho thấy: Các mẫu được cảm ứng với IPTG nồng độ 1 và 2mM có hoạt lực
gelatinase mạnh hơn các mẫu cảm ứng với IPTG nồng độ 3-6mM. Kết quả này chứng tỏ,
hàm lượng IPTG là 1mM là phù hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase.
2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon) đến sự sinh
trưởng của chủng vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32a+/GelE và
hoạt tính của enzyme gelatinase được trình bày trong bảng 4.

(mm)

8.12

7.33

1.34

8.22

8.48

3.52

3.92

1.59

Kết quả trong bảng cho thấy, glucose là cơ chất cacbon phù hợp hơn cả cho sự phát
triển của chủng vi khuẩn biểu hiện. Bên cạnh đó, theo dõi động thái học sinh trưởng của
sinh khối chủng biểu hiện trong 16 giờ, với 2 giờ kiểm tra nồng độ sinh khối 1 lần cho kết
quả trong hình 2.4.

14


Hình 2.4. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến khả năng sinh trưởng của chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose)
Kết quả trong hình 2.4 cho thấy có sự khác biệt lớn về tốc độ tăng trưởng của sinh
khối vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có bổ sung glucose và sucrose so với sinh


Hình 2.8. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nhiệt độ nuôi cấy
Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số trong các mẫu tăng sinh ở nhiệt độ 37oC, 30oC và
28oC; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin của enzyme tái tổ hợp thu được từ
mẫu tăng sinh ở nhiệt độ 37oC, 30oC và 28oC
Kết quả hình 2.8 cho thấy: Ở nhiệt độ 28oC và 30oC có xuất hiện băng protein mờ ở
kích thước 72 kDa, chứng tỏ gelatinase tổng hợp ở mức độ yếu so với ở 37 0C. Bên cạnh đó,
kích thước vùng phân giải gelatin của mẫu tăng sinh ở 37 0C cũng lớn hơn và rõ hơn so với
các mẫu còn lại.
Theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến nồng độ sinh khối và hoạt tính gelatinase cho
thấy chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt nhất cùng như hoạt tính gelatinase
mạnh nhất ở 370C (hình 2.9, 2.10).

Hình 2.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C)

16


Hình 2.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C)
2.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH
Kết quả được thể hiện ở hình 2.11, 2.12.

Hình 2.11. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32a+/GelE (♦: pH=7, : pH= 6, ∆: pH= 8)
Kết quả hình 2.11 cho thấy: Mật độ quần thể trong mẫu tăng sinh ở môi trường có
pH=7 cao hơn so với các mẫu tăng sinh ở môi trường có pH= 6 và 8.

Hình 2.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli

18


Hình 2.15. Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase của sinh khối
chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE
Kết quả hình 2.15 cho thấy: mức độ phân giải cơ chất mạnh nhất trong khoảng thời
gian từ 14-18 giờ, sau đó giảm dần.
Đánh giá hàm lượng và hoạt lực của enzyme bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
và đục lỗ thạch, kết quả thể hiện ở hình 2.16.

Hình 2.16. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị OD khác nhau
Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số trong các mẫu mẫu tăng sinh sau 12, 16 và 24
giờ; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin của enzyme tái tổ hợp thu được từ
mẫu tăng sinh sau 12, 16 và 24 giờ
Kết quả hình ảnh điện di cho thấy: Cả 3 đường chạy 1, 2 và 3 đều xuất hiện băng
tương ứng với kích thước lý thuyết của gelatinase là 72 kDa, nhưng độ đậm của băng không
có sự khác biệt lớn. Kiểm tra hoạt tính của enzyme trong các mẫu tăng sinh cho thấy, sau
12h, 16h và 24h tăng sinh thì kích thước vùng phân giải của mẫu tăng sinh sau 16 giờ lớn
hơn so với kích thước vùng phân giải của mẫu tăng sinh sau 12 giờ và 24 giờ. Từ các kết
quả này chúng tôi xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện là 16h.
2.6. Ảnh hưởng các ion kim loại
Kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của các ion bổ sung đến khả năng phát triển sinh khối và
hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE

19


Kết quả thí nghiệm cho thấy, ion Ca2+ có khả năng tăng cường hoạt tính của
gelatinase tái tổ hợp cũng như mật độ sinh khối chủng biểu hiện E.coli BL21- pET32/GelE.

3.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase
Theo dõi thí nghiệm trong 12 giờ với các mẫu enzyme được xử lý ở 300C, 370C,
450C, 500C, 600C, 700C, 800C chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase

21


Kết quả hình 3.3 cho thấy: Khi có ion Ca2+ thì hoạt tính enzyme cao nhất ở 45°C.
Khi không có Ca2+ hoạt tính của gelatinase luôn thấp hơn nhưng hoạt tính enzyme vẫn đạt
cao nhất ở 45°C. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, nhiệt độ từ 370C đến 50°C không làm
thay đổi vùng liên kết với Ca2+ của enzyme.
Độ bền nhiệt của gelatinase theo dõi trong 60 giờ ở điều kiện xử lý nhiệt là 50°C, cứ
mỗi 6 giờ, enzyme lại được đánh giá hoạt tính một lần, chúng tôi thu được kết quả như hình
3.4.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả hình 3.4 cho thấy: Hoạt tính enzyme ổn định trong 12 giờ đầu, sau đó, thời
gian ủ càng lâu thì hoạt tính càng giảm, đến 60 giờ thì khả năng thủy phân gelatin cho còn
đạt 8-12% so với hoạt tính ban đầu.
Từ các kết quả trên, chứng tỏ,enzyme gelatinase hoạt động tốt nhất ở 50 0C trong 12
giờ xử lý.
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Dưới đây là biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của gelatinase (Hình
3.5).

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò trong việc ổn định hoạt

105
96
95
3
Co2+
100
110
102
92
2+
4
Mn
100
101
99
97
2+
5
Fe
100
105
110
104
2+
6
Mg
100
101
103
100

enzyme gelatinase khi xử lý ở các nồng độ 10%, 20% và 30% trong thời gian 1 giờ tại nhiệt
độ 50ºC.

23


Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme gelatinase.
Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính của
enzyme gelatinase. Các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, isopropanol và
aceton hầu như không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme, hoạt tính của enzyme
tăng nhẹ lên 103% và giảm nhẹ xuống 90% ở nồng độ thí nghiệm là 10 – 30%.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1. Đã tạo thành công chủng E.coli BL21- pET32/GelE biểu hiện gen mã hóa enzyme
gelatinase, kích thước protein tái tổ hợp khoảng 72 kDa tương ứng với kích thước
lý thuyết của enzyme gelatinase A.
2. Đã xác định được các điều kiện phù hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase:
2.1. Nồng độ của chất cảm ứng IPTG phù hợp là 1mM.
2.2. Điều kiện nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon):
+ Glucose là nguồn các bon phù hợp nhất cho sự phát triển cũng như hoạt tính
gelatinase của chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
+ Nguồn nitơ hữu cơ (yeast extract hoặc peptone) là phù hợp nhất cho sự phát triển
của chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
- Chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt nhất cùng như hoạt tính gelatinase
mạnh nhất ở 370C
- pH = 7 là pH phù hợp nhất để biểu hiện gen mã hóa gelatinase.
- Thời gian tăng sinh chủng biểu hiện là 16h.
- Sự phối hợp các ion phù hợp cho sự tăng sinh chủng vi khuẩn tái tổ hợp

enzyme.

2. KIẾN NGHỊ
-

Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện thu hồi enzyme để thu được gelatinase có hoạt tính
cao nhất.
Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân các phụ phẩm trong chế biến cá da
trơn để sản xuất các sản phẩm chất lượng cao dùng cho thực phẩm, mỹ phẩm.

25