BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ HƢỜNG
MÃ SINH VIÊN: 1101250

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA
Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ
TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAI THỊ HƢỜNG
MÃ SINH VIÊN: 1101250

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA
Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ
TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Kiều Thị Hồng
2. DS. Tô Ngọc Sắc
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

HÀ NỘI – 2016

1.1.

ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC…………………………….…2

1.2.

Các vi sinh vật thƣờng dùng trong các chế phẩm probiotic....3

1.3.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và
Việt Nam…………………………………………………….…..3

1.4.

Lactobacillus sporogenes..……………………………………....5

1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa điều kiện nuôi cấy…….….6
1.4.2. Vai trò của Lactobacillus sporogenes……………………………9
1.4.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về L. sporogenes……..10
1.5. Phƣơng pháp đông khô………………………………………..11
1.5.1. Khái niệm……………………………………………………….11
1.5.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô………………….………..11
1.5.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô……………….…..12
1.5.4. Một số tá dược thường dùng trong đông khô VSV…………….12
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU…………………………………………………………………………….14
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu……………………….….14
2.1.1. Nguyên vật liệu………………………………………………...14
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu…………………………15


(Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc

CPA
FAO

Cryoprotectant
(Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương thế

HMG-CoA giới
3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A
L. sporogenes Lactobacillus sporogenes
MRS

(de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
lactic

MT

Môi trường

Vòng/phút

(revolutions per minute) Vòng mỗi phút

VSV

Vi sinh vật

WHO

26

nuôi cấy trên môi trường MT4
Bảng 3.2

Mật độ L. sporogenes trong mẫu đông khô với các

28

thể tích nuôi cấy khác nhau
Bảng 3.3

Mật độ L. sporogenes trong mẫu đông khô theo

30

thời gian nuôi cấy
Bảng 3.4

Biến thiên mật độ VSV và hàm ẩm của mẫu đông
khô L. sporogenes trong quá trình bảo quản

35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

Trang



25

subtilis sau khi nuôi cấy trong môi trường tạo bào tử
MT4
Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L.sporogenes

28

trong mẫu đông khô vào thể tích nuôi cấy
Hình 3.5

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L. sporogenes

31

trong mẫu đông khô vào thời gian nuôi cấy
Hình 3.6

Hình ảnh khuẩn lạc của L. sporogenes pha loãng ở

34

nồng độ 10-6 sau 2 tuần bảo quản
Hình 3.7

Hình ảnh khuẩn lạc của L. sporogenes pha loãng ở


sống sót của Lactobacillus sporogenes trong quá trình tạo nguyên liệu đông
khô ”. Nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes.
2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình
bảo quản.


2

1.1.

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
Đại cƣơng về probiotics
Vào đầu thế kỷ 19, những vai trò tích cực của 1 số vi khuẩn lần đầu tiên

được quan sát bởi nhà khoa học người Nga Metchnikoff (1845-1916). Ông nhận
thấy rằng: Những người nông dân Bungari thường xuyên sử dụng sữa lên men
lactic acid thường sống mạnh khỏe và có tuổi thọ cao. Cùng thời đó một giáo sư
ở viện Pasteur – Pari cũng nhận thấy: 1 số vi khuẩn như Clostria có sẵn trong
đường ruột trong quá trình phân giải protein sinh ra 1 số chất gây nhiễm độc
ruột (như phenol, indols và amoniac...), khi sử dụng sữa lên men với vi khuẩn
lactic acid thì đường ruột không còn bị nhiễm độc nữa. Giáo sư cho rằng: do quá
trình lên men lactose tạo độ pH thấp và vì thế mà ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn phân giải protein.
Từ những khám phá ban đầu đó, giới khoa học bắt đầu quan tâm nghiên
cứu nhóm vi khuẩn có lợi này. Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu
tiên vào năm 1953 bởi Kollath. Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc
từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [16]. Năm 1989,
Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ
sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện

Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam
Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã được

biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng
probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20. Năm 1998,
Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và
quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật [11].
Netherwood và cộng sự (1999) [35]; Gong và cộng sự (2002) [21]; Yoon
và cộng sự (2002) [41] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu
trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới
tác động của probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo


4

nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật
đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ.
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu
biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế. Có một số
tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự
kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản
xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng
sinh…), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn
dịch ruột [28], [36].
Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản
phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng
được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống
như bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng
khác như viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các

dưới tên gọi Bacillus coagulans do một đợt bùng phát của việc một sản
phẩm đặc biệt của sữa bị đông vón hàng loạt [22]. Năm 1932, vi khuẩn này
lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là Lactobacillus sporogenes
[30]. Đến năm 1957, vi sinh vật này được phân loại lại trong Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hóa và danh pháp
chính xác hiện tại là Bacillus coagulans [14]. Do vi khuẩn này có các đặc điểm
của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai
họ Lactobacillaceae và Bacillaceae vẫn còn gây nhiều tranh cãi [24]. Ngày
nay, vi khuẩn này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi
Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm
thương mại xuất hiện trên thị trường. Do nguồn gốc của giống vi sinh vật
trong khóa luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng.


6

1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: dạng tế bào
sinh dưỡng và dạng bào tử.
1.4.1.1.Tế bào sinh dƣỡng
 Đặc điểm hình thái:
 Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình
que, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [22], [25].
 Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở
dạng chuỗi ngắn [22], [25].

Hình 1.1. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi
Lactobacillus và Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của
Lactobacillus sporogenes với hai chi này.


-

+

Sinh bào tử

+

-

+

Khả năng di động

+

+/-

+

Sinh acid lactic

+

+

-

+

bất lợi từ môi trường: chúng vẫn sống ngay cả sau khi xử lý nhiệt ở 100oC trong
20 phút trong dung dịch đệm phosphat pH 7 và có khả năng nảy mầm trở lại kể
cả trong dịch pha loãng của acid HCl (pH 4,6 – 5,6) hay của NaOH (pH 7,6 –
9,6), trong dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nước
cất; bào tử có khả năng chịu được kháng sinh gấp 2 – 8 lần so với tế bào sinh
dưỡng [9].
 In vivo


9

Sau khi được đưa vào cơ thể, Lactobacillus sporogenes xuống đến dạ dày
ở dạng bào tử. Dưới tác động của pH thấp và sự co bóp của dạ dày, các lớp màng
của bào tử hút nước và trương phồng lên; sự gia tăng hàm lượng nước làm tăng tỉ
lệ trao đổi chất trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử.
Khoảng thời gian trung bình từ lúc uống đến lúc bào tử nảy chồi trong tá tràng là
khoảng 4 – 6 giờ, khoảng 85% vi khuẩn ban đầu xuống được đến ruột, tại tá
tràng, bào tử nảy mầm và phát triển nhanh chóng. Bào tử Lactobacillus
sporogenes tồn tại trong ống tiêu hóa khoảng 7 ngày, sau đó được thải trừ ra
ngoài qua phân [9], [23].
1.4.2. Vai trò của Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus sporogenes có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật
gây bệnh. Hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng đường ruột cấp tính gây ra bởi
vi khuẩn gây bệnh ở động vật; cho hiệu quả điều trị cao hơn khi phối hợp với vi
khuẩn probiotic truyền thống khi điều trị cho con người.
Lactobacillus sporogenes còn ngăn ngừa tiêu chảy có nguyên nhân liên quan
đến kháng sinh. Việc phối hợp điều trị cho thấy giảm số lượng bệnh nhân tiêu
chảy và rút ngắn thời gian tiêu chảy.Cải thiện sức khỏe đường ruột. Hiệu quả
trong việc giảm co thắt đường ruột, đau bụng và đầy hơi ở bệnh nhân bị hội
chứng ruột kích thích.Cải thiện đau bụng, chướng bụng và các triệu chứng



11

1.5. Phƣơng pháp đông khô
1.5.1. Khái niệm:
Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng
cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà
không qua trạng thái lỏng. Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật
liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu. Như vậy, đông
khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp
(thường là âm). Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước. Ở áp suất nhất
định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng
hoa cũng tăng [10], [27], [29].
1.5.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc
được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ
trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới
nhiệt độ điểm ba của ẩm [10], [27], [29].
 Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng
thời tiến hành hút chân không. Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ
thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [10], [27], [29].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của
vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng. Quá trình sấy trong
giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình
thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai
đoạn thăng hoa [10], [27], [29].




thương màng vi khuẩn tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại,
độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [26]. Để ngăn chặn
hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá
dược bảo vệ trong quá trình đông khô [12].
Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất
được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào
trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm
khô [26].
Một số tá dược được sử dụng trong đông khô bao gồm: sữa gầy là sữa béo
đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ yếu), acid amin, các
vitamin và khoáng chất; các loại đường như glucose, lactose, dextrin glucose,...
Các acid amin: arginin, acid glutamic,... Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự
nhiên và polyme.
Trong nghiên cứu này tá dược được sử dụng là sữa gầy:
Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành
phần có chứa không quá 0,5% chất béo. Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa
gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose.
Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có
thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường protein. Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại
đi. Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra
một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của
tế bào ở mức thấp nhất [15].
Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa giúp ổn định pH trong quá
trình đông khô [26].


14

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Triamoni citrate

Trung Quốc

Acetat natri

Trung Quốc

Sữa gầy

Trung Quốc

Natri clorid

Trung Quốc

Thạch agar

Việt Nam



0.5 g

MnSO4.4H2O

0.005 g

Natri acetat

0.5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường MRS thạch (MT 2)
MT 2 = MT 1 + Thạch agar (2 g/100 mL môi trường)
 Môi trường canh thang (MT3)
Pepton

1.0

Cao thịt

0.5 g

Natri clorid

0.5 g


Mangan sulfat

0.001 g

Thạch

15.0 g

Nước

1000 ml


16

2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân phân tích

Đức ( Satorious)

Cân kỹ thuật

Đức ( Satorious)

Lò vi sóng


Tủ lạnh sâu

Đức

Thiết bị đông khô

Đức

- Các dụng cụ sử dụng: Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri, đèn cồn…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes
- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dịch nuôi cấy ban đầu đến số lượng L.
sporogenes trong nguyên liệu đông khô.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến số lượng L. sporogenes trong
nguyên liệu đông khô.


17

2.2.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong quá
trình bảo quản
- Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời
gian bảo quản .
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường MRS thạch (MT2) theo công thức ở mục 2.1.2, đun nóng
làm đồng nhất các thành phần trong môi trường, phân phối vào các ống
nghiệm, mỗi ống 7 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút. Đặt các
ống nghiệm nằm nghiêng, môi trường không lên quá 2/3 chiều cao của ống, để