BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
ĐÀO BÁ HOÀNG TÙNG
Mã sinh viên: 1101578
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
PHYTOSOME QUERCETIN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI DUNG MÔI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
ĐÀO BÁ HOÀNG TÙNG
Mã sinh viên: 1101578
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
PHYTOSOME QUERCETIN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP BỐC HƠI DUNG MÔI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Vũ Thị Thu Giang
2. Th.S. Nguyễn Hồng Trang
Nơi thực hiện:
Bộ môn bào chế
1.1.1.
Nguồn gốc .................................................................................................... 2
1.1.2.
Công thức hóa học ....................................................................................... 2
1.1.3.
Tính chất lý hóa ........................................................................................... 2
1.1.4.
Tác dụng dƣợc lý ......................................................................................... 3
1.1.5.
Dƣợc động học ............................................................................................. 4
1.1.6.
Chỉ định........................................................................................................ 4
1.1.7.
Tác dụng không mong muốn ....................................................................... 4
1.1.8.
Đánh giá một số đặc tính của phytosome .................................................. 10
Bào chế phytosome ........................................................................................... 11
1.3.1.
Bào chế phức hợp phytosome thô bằng phƣơng pháp bốc hơi dung môi . 11
1.3.2.
1.4.
Phƣơng pháp làm giảm và đồng nhất kích thƣớc phytosome .................... 11
Một số nghiên cứu về Phytosome .................................................................... 12
1.4.1.
Một số nghiên cứu về phức hợp phytosome của các dƣợc chất khác........ 12
1.4.2.
Một số nghiên cứu về phytosome quercetin .............................................. 13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 15
2.1.
Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu .................... 15
2.2.
Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin ............. 19
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 21
3.1.
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng quercetin bằng HPLC ........ 21
3.1.1.
Độ đặc hiệu ................................................................................................ 21
3.1.2.
Khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống sắc kí ........................................... 21
3.1.3.
Tính tuyến tính ........................................................................................... 22
3.1.4.
Độ lặp lại .................................................................................................... 22
3.1.5.
Độ đúng...................................................................................................... 23
3.2.
Đánh giá khả năng giải phóng dƣợc chất của phức hợp phytosome ......... 37
3.4.4.
Chứng minh khả năng tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong
phytosome ............................................................................................................... 38
3.5.
Bàn luận ............................................................................................................ 43
3.5.1.
Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phức hợp ............................ 43
3.5.2.
Phƣơng pháp đánh giá phức hợp ............................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 47
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ/cụm từ đầy đủ
TT
Viết tắt
6
IR
7
KTTP
Kích thƣớc tiểu phân
8
NSX
Nhà sản xuất
9
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity Index)
P-NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đồng vị 31P
11
SEM
Phổ hồng ngoại (Infared)
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa quercetin lƣu hành trên thị trƣờng.............................. 4
Bảng 2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 15
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký ................................. 21
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí........................................... 22
Bảng 3.3. Bảng kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí ...................................... 23
Bảng 3.4. Độ tan của quercetin trong các môi trƣờng khác nhau .................................. 24
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ tan của phức hợp đƣợc bào chế .................................... 26
Bảng 3.6. Kích thƣớc tiểu phân và phân bố kích thƣớc tiểu phân của hỗn dịch
phytosome quercetin bào chế với các nhiệt độ hydrat hóa khác nhau ........................... 27
Bảng 3.7. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin đƣợc siêu âm trong các
khoảng thời gian khác nhau ........................................................................................... 30
Bảng 3.8. Kích thƣớc tiểu phân và phân bố kích thƣớc tiểu phân của hỗn dịch
phytosome bào chế ở nhiệt độ hydrat hóa khác nhau .................................................... 32
Bảng 3.9. Một số đặc tính của phức hợp bào chế với tỷ lệ mol quercetin:HSPC khác
nhau ................................................................................................................................ 33
Bảng 3.10. Độ tan của phytosome quercetin trong môi trƣờng nƣớc khi thay đổi tỷ lệ
quercetin:HSPC .............................................................................................................. 34
Bảng 3.11. Số sóng gốc –OH trong phân tử quercetin, gốc N+(CH3)3, (RO)2PO2- trong
phân tử HSPC của các mẫu ............................................................................................ 39
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử quercetin ............................................................ 2
Hình 1.2. Cấu trúc của phytosome ................................................................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa .................. 6
Hình 1.4. Phổ 31P-NMR chất rắn của một số dạng phospholipid trong phức hợp ........... 9
Nhằm khắc phục hạn chế này, nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện theo các
hƣớng khác nhau nhƣ: bào chế chế phẩm dƣới dạng tiểu phân nano, tạo phức hợp với
cyclodextrin… Một trong những phƣơng pháp đƣợc tập trung nghiên cứu trong những
năm gần đây đó là tạo phức hợp phytosome giữa quercetin và phospholipid, với nhiều
ƣu điểm nhƣ: độ bền cao, khả năng nạp thuốc tốt, tăng thời gian lƣu thông của thuốc
trong hệ tuần hoàn, tăng khả năng thấm nội bào, tăng hấp thu dƣợc chất qua da và có
khả năng dƣỡng da của phosphatidylcholin…
Để góp phần bƣớc đầu ứng dụng công nghệ phytosome cho các dƣợc chất ít tan có
nguồn gốc dƣợc liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome
quercetin bằng phƣơng pháp bốc hơi dung môi” với hai mục tiêu chính :
-
Bào chế đƣợc phytosome quercetin bằng phƣơng pháp bốc hơi dung môi.
-
Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng của hỗn dịch chứa phức hợp phytosome
quercetin.
2
1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Quercetin
1.1.1. Nguồn gốc
Quercetin là một flavonoid, đƣợc phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercitrin
có trong vỏ cây Quercus tinctoria. Trong tự nhiên, quercetin phân bố rất rộng rãi và
Bột kết tinh màu vàng xanh, hình kim.
-
Bình thƣờng tồn tại ở dạng dihydrat, trở nên khan ở 95-97oC.
-
Nhiệt độ nóng chảy 316-317oC.
-
Độ tan: Ít tan trong nƣớc và ether, dễ tan trong aceton và ethanol [24].
Hóa tính:
-
Tính oxy hóa: Trong môi trƣờng pH = 2, quercetin bị oxy hóa bởi H2O2 tạo ra
quinon [13].
3
-
Tính acid yếu: Quercetin trong dung dịch ammonic có màu vàng sáng [4].
-
phẩm và dƣợc phẩm để điều trị các bệnh về da và làm đẹp da [9].
-
Chống dị ứng: Quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ tế bào ƣa base
[2].
-
Tác dụng chống viêm: Quercetin làm giảm hiện tƣợng phù bàn chân do
albumin, histamin, serotonin gây nên cũng nhƣ làm giảm triệu chứng sƣng khớp khuỷu
do enzym hyaluronidase [2].
Ngoài ra, quercetin còn nhiều tác dụng khác nhƣ kìm hãm sự phát triển tế bào
ung thƣ, kháng nấm phổ rộng, ức chế vi khuẩn Gram (+), ức chế virus HIV, chống
nhiễm và chống sao chép đối với một số loại virus nhƣ virus á cúm, virus HSV, chống
kết tập tiểu cầu, điều trị bệnh gout, ngăn chặn các biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng
[5], [9], [16], [22].
4
1.1.5. Dƣợc động học
Quercetin kém hấp thu qua đƣờng tiêu hóa. Trong huyết tƣơng, 98% quercetin
liên kết với protein, và đƣợc tìm thấy ở dạng liên hợp với acid glucuronic, sulfat và
methyl trong khi hầu nhƣ không có dạng tự do. Quercetin và dạng liên hợp của nó
đƣợc chuyển đến gan và từ gan có thể phân bố khắp các mô trong cơ thể nhờ các
albumin trong huyết tƣơng. Thời gian bán thải của quercetin trong cơ thể là
t1/2 = 25 giờ. Chế độ ăn giàu mỡ, chất béo làm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian
thải trừ quercetin [14], [16].
1.1.6. Chỉ định
500 mg
Quercetin
Viên nang
2
Quercetin(GNC)
500 mg
Quercetin
Viên nén
5
3
4
Quercetin phytosome
(Research Thorne)
Quercetin, NutraDrops™
250 mg
1 mg/ml
6
Cấu tạo của phytosome gồm hai phần chính: Phospholipid và dƣợc chất dƣợc liệu.
Phospholipid
-
Cấu trúc của phospholipid gồm 2 phần: phosphatidyl có bản chất thân dầu và
cholin có bản chất thân nƣớc. Trong phức hợp phytosome, đầu cholin của phân tử
phospholipid sẽ gắn với dƣợc chất, trong khi đầu phosphatidyl bao bọc dƣợc chất tạo
nên tiêu phân hình cầu.
-
Hai loại phospholipid hay đƣợc sử dụng trong bào chế phytosome là lecithin, và
một nguyên liệu tinh khiết hơn là phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC).
So với lecithin, HSPC có ƣu điểm là độ tinh khiết cao và tƣơng đối ổn định về mặt hóa
học do hạn chế đƣợc các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chƣa no, từ đó giúp màng
lipid bền vững hơn, hạn chế hiện tƣợng hỏng màng.
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
Dược chất
-
Dƣợc chất ở đây là các flavonoid nguồn gốc dƣợc liệu, đƣợc gắn vào đầu phân
cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng, và có sự hình thành các liên
kết hydro giữa hydroxyl phenol của dƣợc chất và ion phosphat trên nhánh phospholipid
cho từng phân tử dƣợc chất [10], [23].
thời gian tồn tại của chất đó trong cơ thể và qua đó tăng tác dụng sinh học.
-
Tác dụng hƣớng đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển vào nội bào.
-
Phytosome đƣợc sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực mỹ phẩm do có khả năng
tăng tính thấm của dƣợc chất qua da, lý do là đặc tính thân dầu của phytosome giúp
dƣợc chất dễ dàng vƣợt qua lớp màng sinh học giàu lipid.
Do phytosome cải thiện đƣợc độ tan của dƣợc chất trong muối mật nên tăng tác
-
dụng của thuốc tại gan [10], [23], [29].
Nhược điểm
Đa số các phƣơng pháp bào chế phytosome đều sử dụng dung môi hữu cơ để
-
hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng cũng nhƣ môi trƣờng.
Kỹ thuật sử dụng khí nén và chất lỏng siêu tới hạn có thể khắc phục đƣợc nhƣợc điểm
này nhƣng kỹ thuật này rất phức tạp, yêu cầu áp suất cao 3000 - 4500 psi.
1.2.4. Phƣơng pháp đánh giá tƣơng tác giữa dƣợc chất và phospholipid trong
phytosome
Để xác định cấu trúc của phytosome cũng nhƣ đánh giá tƣơng tác phân tử giữa
dƣợc chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
(H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phân tích nhiệt quét
sẽ xây dựng đƣợc phổ đồ cộng hƣởng từ hạt nhân [25].
Mục đích: Dƣợc chất quercetin và phospholipid trong phytosome tƣơng tác với
nhau sẽ làm thay đổi trƣờng điện từ của một nhóm chức năng nào đó và làm độ dịch
chuyển hóa học của nhóm đó thay đổi. Dựa vào đó, có thể biết thông tin về những
tƣơng tác đã xảy ra [27], [32]. Phổ 1H-NMR và 31P-NMR chất lỏng đã đƣợc sử dụng để
đánh giá tƣơng tác trong phức hợp phytosome silybin [32].
Ngoài ra, có thể sử dụng phổ 31P-NMR chất rắn để xác định trạng thái tập hợp
của phospholipid trong phức hợp: Khi ở dạng lipid kép, phospholipid có tính chất đối
9
xứng trục, do đó phổ 31P-NMR doãng rộng bất đối xứng và vai doãng về phía trƣờng
thấp. Khi ở dạng phospholipid lục giác, phổ hẹp hơn về phía trƣờng cao với vai doãng
về phía trƣờng cao. Ở dạng khác của phospholipid nhƣ micell thì phổ đối xứng trung
tâm do sự di chuyển đẳng hƣớng [19].
Hình 1.4. Phổ 31P-NMR chất rắn của một số dạng phospholipid trong phức hợp
Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)
Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử đƣợc đặt trong buồng kín và gia nhiệt để
chúng có cùng nhiệt độ. Sự chênh lệch nhiệt lƣợng cần thiết để duy trì nhiệt độ của 2
mẫu bằng nhau cho biết thông tin về quá trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian
quét. Nhiệt lƣợng chênh lệch này đƣợc xác định nhƣ một hàm của sự chênh lệch nhiệt
độ tức thời giữa 2 mẫu [12]. Khi dƣợc chất và tá dƣợc có tƣơng tác với nhau sẽ làm các
quá trình nhiệt bị thay đổi, điều đó đƣợc thể hiện bằng những thay đổi trên đồ thị DSC
[12].
Mục đích: Từ những phân tích về sự thay đổi trên đồ thị DSC, ta có thể chứng
Kích thƣớc và phân bố kích thƣớc: Xác định kích thƣớc bởi phƣơng pháp tán xạ
ánh sáng động học (DLS).
-
Độ bền vững của phytosome: Đánh giá bằng cách xem xét kích thƣớc và cấu
trúc của phytosome sau thời gian bảo quản.
-
Hiệu suất phytosome hóa hay hiệu suất nạp thuốc: đƣợc đo bằng cách ly tâm
loại bỏ dƣợc chất tự do lắng xuống, định lƣợng dƣợc chất ở phần dịch còn lại.
H% = (lƣợng DC tạo thành phức hợp/ lƣợng DC đƣa vào ban đầu) x100%
-
Định lƣợng dƣợc chất: Bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
hoặc các phƣơng pháp quang phổ phù hợp [10], [23], [29].
11
1.3. Bào chế phytosome
1.3.1. Bào chế phức hợp phytosome thô bằng phƣơng pháp bốc hơi dung môi
Phƣơng pháp bốc hơi dung môi là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng trong bào chế
phytosome vì tính tiện lợi, dễ thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải
tiến và nâng cấp quy mô.
Phospholipid, dƣợc chất và các thành phần khác đƣợc hòa tan trong hỗn hợp
ổn định của phytosome bào chế [15].
Đồng nhất hóa áp suất cao: Nguyên tắc của phƣơng pháp là dƣới áp suất của
khí trơ, nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thƣớc xác định trong thiết bị đồng nhất
hóa. Nén tuần hoàn nhiều vòng cho đến khi thu đƣợc kích thƣớc mong muốn. Ƣu điểm
của phƣơng pháp này là dễ nâng cấp quy mô, kích thƣớc thu đƣợc khá đồng nhất [6].
Đùn ép qua màng: Hỗn dịch phức hợp đƣợc đùn ép qua màng polycarbonat có
kích thƣớc lỗ màng xác định, thu đƣợc hỗn dịch có kích thƣớc tiểu phân gần với kích
thƣớc của lỗ màng. Nguyên lí của phƣơng pháp đƣợc mô tả nhƣ sau: hỗn dịch phức
hợp đƣợc đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, xếp đồng trục và kích thƣớc xác định,
ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp. Các tiểu phân có kích thƣớc lớn hơn lỗ
màng sẽ đi qua màng, các tiểu phân nhỏ thì hầu nhƣ không thay đổi kích thƣớc khi qua
màng, do đó hỗn dịch sau đùn ép có kích thƣớc đồng nhất. Ƣu điểm của phƣơng pháp
này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ [19].
1.4. Một số nghiên cứu về Phytosome
1.4.1. Một số nghiên cứu về phức hợp phytosome của các dƣợc chất khác
Angelico R. và cộng sự (2014) đã bào chế phytosome silybin với phospholipid là
Soybean lecithin epikuron 130P bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo. Phức hợp sau khi
bào chế đƣợc đánh giá bằng phổ 2D (1H-1H NOESY) NMR, kết quả cho thấy có sự
tƣơng tác giữa silybin và phospholipid để hình thành phức hợp phytosome [32].
Malay K.D và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế rutin phytosome bằng
phƣơng pháp bốc hơi dung môi. Kết quả cho thấy các phytosome bào chế đều có độ tan
trong nƣớc cao hơn rutin tinh khiết, phytosome bào chế với tỷ lệ rutin:phospholipid 1:1
13
có sự cân bằng tốt hơn giữa đặc tính thân dầu và đặc tính thân nƣớc (3,11 ± 0,08) khi
so sánh với dƣợc chất rutin. Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi
rời rạc. Hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức hợp
phyto-phospholipid. Theo kết quả nghiên cứu nhiễu xạ tia X, rutin khi tạo phức với
Singh D. và cộng sự [11] đã nghiên cứu bào chế quercetin phytosome bằng
phƣơng pháp bốc hơi dung môi, với phospholipid sử dụng là phosphatidyl cholin đậu
nành. Kết quả cho thấy đã có liên kết đƣợc tạo thành giữa dƣợc chất và phospholipid,
cùng với các thay đổi về đặc tính lý hóa so với dƣợc chất ban đầu nhƣ giảm nhiệt độ
chảy và enthalpy, giảm mức độ kết tinh, tăng độ tan trong nƣớc. Tác dụng chống oxy
hóa của phytosome so với dạng dƣợc chất tự do là không có nhiều thay đổi đáng kể.
Từ kết quả nghiên cứu về phytosome quercetin cũng nhƣ một số các phytosome
khác nhƣ phytosome rutin, phytosome curcumin đã phần nào chứng minh đƣợc ƣu
điểm vƣợt trội của dạng bào chế này trong việc làm tăng khả năng hấp thu của dƣợc
chất khó tan. Tuy nhiên, số lƣợng các nghiên cứu đã công bố về phytosome nói chung
và phytosome quercetin nói riêng hiện nay là chƣa nhiều. Bên cạnh đó, trên thị trƣờng
chỉ lƣu hành một số rất ít chế phẩm chứa phytosome quercetin nhƣ Quercetin
Phytosome, Quercenase®…. Từ thực tế trên, nhằm góp phần bƣớc đầu ứng dụng công
nghệ phytosome vào dƣợc chất có nguồn gốc dƣợc liệu, từ đó làm cơ sở để tận dụng
đƣợc nguồn dƣợc liệu phong phú của nƣớc nhà, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề
tài này.
15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Phytosome quercetin
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT
4
Ethanol
Trung Quốc
NSX
5
Lecithin
Lipoid – Đức
NSX
6
Methanol
Trung Quốc
NSX
7
Methanol dùng cho HPLC
Merck – Đức
Phƣơng tiện nghiên cứu:
+
Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung
tích 1000 ml (Buchi – Đức).
+
Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ
thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, màng lọc 0,2 µm, màng lọc
Amicon Ultra-4.
+
Máy đo pH Eutech instrument pH 510 (Mỹ).
+
Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức).
+
Máy hòa tan Erweka-DT700 (Đức).
16
+
Khảo sát độ tan của quercetin trong methanol và các dung dịch pH khác nhau.
-
Đánh giá các đặc tính của phức hợp đƣợc bào chế với 2 loại nguyên liệu
phospholipid khác nhau là lecithin và HSPC.
-
Đánh giá khả năng tạo phức giữa quercetin và phospholipid thông qua các
phổ1H-NMR, FTIR, XRD, DSC.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp bào chế phytosome quercetin
Quy trình bào chế phytosome quercetin nhƣ sau:
-
Cân và hòa tan quercetin trong 20 ml methanol.
-
Cân và hòa tan phospholipid trong 30 ml dichloromethan.
-
Phối hợp hai dung dịch trên. Sau đó đƣa vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ
thống cất quay. Cho bình quay trong điều kiện thời gian và nhiệt độ nhất định, tốc độ
quay 150 vòng/phút. Sau đó, hệ thống cất quay đƣợc hút chân không, điều chỉnh áp
suất để dung môi bay hơi từ từ. Sau 15 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết và
Copyright: Tài liệu đại học ©