BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH HIỀN
Mã sinh viên: 1101178

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI
GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ
ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH
BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH HIỀN
Mã sinh viên: 1101178

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI
GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ
ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH
BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân
2. DS. Nguyễn Thị Thu Phƣơng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1 Probiotics ...................................................................................................... 2
1.1.1 Đại cương về probiotics ............................................................................... 2
1.1.2 Bào tử ........................................................................................................... 4
1.2 Bacillus clausii .............................................................................................. 7
1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii ........................................... 7
1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii. ..................................................................... 9
1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B.clausii. .................................................. 12
1.3 Phƣơng pháp đông khô. ............................................................................ 13
1.3.1 Khái niệm về phương pháp đông khô. ....................................................... 13
1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô ....................................................... 13
1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô ............................................... 14
1.3.4 Ứng dụng của phương pháp đông khô ......................................................... 14
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị. ............................................................ 15
2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất. ................................................................................. 15
2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu. ........................................................ 16
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ. .................................................................................... 16
2.2 Nội dung nghiên cứu. ................................................................................ 17
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được
sinh khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii. ............................................................. 17
2.2.2 Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu
Bacillus clausii ở dạng bột đông khô. ....................................................................... 17


2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu. ......................................................................... 17


ARN

Acid Ribonucleic

ATCC
CFU
DSM

American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật
Hoa Kì)
Colony Forming Unit
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí
hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức)

ĐK

Đông khô

FAO

Food and Argiculture Organization

MT1

Môi trường canh thang

OD

Optical Density (mật độ quang)


Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii

11

3

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

15

4

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

16

5

Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh bào tử của B. clausii theo

24

thời gian nuôi cấy
6

Bảng 3.2 Số lượng VSV trong các mẫu đông khô sau khi xử lý ở

30


2

Hình 1.2 Cấu tạo bào tử vi khuẩn

6

3

Hình 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii

8

4

Hình 1.4 Bào tử vi khuẩn B. clausii dưới kính hiển vi (độ phóng đại

8

1000 lần)
5

Hình 3.1 Lượng sinh khối và bào tử B. clausii thu được theo thời

25

gian
6

Hình 3.2 Hình ảnh tế bào và bào tử của B. clausii sau thời gian nuôi


Bifidobacterium) và vi sinh vật có hại (như Clostridium, Staphylococcus…). Hệ vi sinh
vật đường ruột thường xuyên chịu tác động bởi các yếu tố như chế độ ăn, sự lão hóa,
dùng kháng sinh,… làm mất cân bằng giữa vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, tạo điều
kiện cho vi khuẩn có hại lấn át và gây bệnh, điển hình là bệnh tiêu chảy. Vì vậy việc
duy trì sự cân bằng của hệ vi sinh đường ruột là vô cùng quan trọng trong việc hỗ trợ
các chức năng về tiêu hóa cũng như miễn dịch. Sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi
probiotic nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, phòng và trị bệnh được sử dụng khá
phổ biến và ngày càng có xu hướng gia tăng cả về số lượng và dạng bào chế. Tuy
nhiên, theo các báo cáo gần đây, khoảng 50% sản phẩm probiotic trên thị trường Việt
Nam không đủ về số lượng vi sinh vật còn sống, thậm chí không có vi sinh vật sống.
Sự bất cập này xảy ra có lẽ là do các nghiên cứu trong nước về quy trình nuôi cấy tạo
nguyên liệu probiotic cung cấp cho sản xuất thuốc còn hạn chế 5 7.
Trong các chế phẩm probiotic, một sản phẩm hiện đang rất được ưa sử dụng là
Enterogermina chứa Bacillus clausii dạng bào tử (đăng ký ở Italy năm 1958). Tuy
nhiên rất khó để tìm thấy các tài liệu công bố về quy trình sản xuất và xử lý sinh khối
để thu được bào tử Bacillus clausii độ tinh sạch cao. Để giải quyết vấn đề này chúng
tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý
đến khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii ”, với các mục tiêu sau:
1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu được sinh
khối dưới dạng bào tử Bacillus clausii.
2. Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và độ ổn định của nguyên liệu ở dạng
bột đông khô.


2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1 Probiotics
1.1.1 Đại cƣơng về probiotics
1.1.1.1 Khái niệm

thuộc nhóm lactic có khả năng phân giải chất xơ tạo ra các chất mà cơ thể có thể tiêu
hóa được 16 17 54.
Sản phẩm sữa chua chứa vi khuẩn probiotic có hoạt tính beta-galactosidase, giúp
cải thiện tiêu hóa lactose và loại trừ các triệu chứng không dung nạp ở những người
kém hấp thu lactose 47.
 Khả năng phòng và trị bệnh
- Sử dụng các VSV probiotic có tác dụng làm giảm tiêu chảy do rotavirus, giảm
tiêu chảy do kháng sinh và do thuốc nói chung. Chế phẩm chứa các loại VSV như
Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, nấm men làm giảm đáng kể
sự phát triển của bệnh tiêu chảy liên quan kháng sinh. Một số nghiên cứu cho rằng chi
nấm men Saccharomyces boulardii được sử dụng hiệu quả cho bệnh do Clostridium
difficile gây ra 44.
- Bệnh không dung nạp lactose: Người thiếu men lactase nếu tiêu thụ một lượng
lactose lớn sẽ gây ra các triệu chứng đầy hơi, buồn nôn, tiêu chảy. Tuy nhiên tình trạng
này sẽ được cải thiện đáng kể nếu họ sử dụng sữa lên men, do trong sữa lên men lượng
lactose đã giảm đi đáng kể, ngoài ra sữa lên men còn chứa một lượng lactase có nguồn
gốc từ vi sinh vật giúp tiêu hóa đường lactose 47.
- Viêm đại tràng giả (do Clostridium difficile) : khi dùng Lactobacillus sẽ ngăn
ngừa tái phát cho bệnh nhân viêm đại tràng giả đã được điều trị. Sử dụng probiotics
không thay thế được thuốc kháng sinh nhưng có thể xem như là một phương tiện để
sửa chữa những thiếu sót trong cơ thể vật chủ bởi chế độ ăn uống và môi trường, stress;


4

làm cho vật chủ đề kháng hơn với bệnh tật và làm giảm tần suất sử dụng kháng sinh
44.
- Tác dụng lên bệnh viêm ruột hoại tử ở trẻ nhẹ cân non tháng, một nghiên cứu cho
thấy : chế độ ăn probiotics Infloran - sản phẩm chứa Lactobacillus acidophilus và
Bifidobacterium infantis kết hợp cùng sữa mẹ giúp giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm

tử là glutamine synthetase, RNA polymerase, và pyruvate kinase. Pyruvate kinase là
enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa phosphoenolpyruvate có vai trò trong cả
tăng trưởng (glycolysis) và hình thành bào tử. Glutamine synthetase là enzyme lớn chịu
trách nhiệm cho amoniac để hợp thành axit amin tham gia vào tạo thành bào tử bằng
các sản phẩm catabolic chứa nitơ 33.
Hầu hết vi khuẩn Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể cảm ứng tạo bào
tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt,
đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nito, hoặc phospho 3.


6

Với Bacillus subtilis, một số nghiên cứu chỉ ra pH thích hợp để tạo lượng bào tử
nhiều nhất là từ khoảng 6 – 8 26. Mangan được cho là yếu tố kích thích quá trình tạo
bào tử ở một số vi khuẩn. Trong quá trình hình thành bào tử, ion mangan trong môi
trường sẽ bị oxy hóa thành mangan oxyd bám trên bề mặt bào tử tạo cho bào tử khả
năng kháng nhiệt 27. Theo N. Vasantha và Ernst Freese, Mn2+ là yếu tố cần thiết để
hình thành bào tử, chúng tham gia kích hoạt PGA-Mutase do đó ngăn cản sự tích tụ của
các ức chế 3-PGA và đảm bảo việc cung cấp các hợp chất carbon trong cả hai phần của
con đường chuyển hóa kết nối bởi PGA-Mutase 41 50. Quá trình hình thành bào tử
này thường mất khoảng 6 – 8 tiếng, tạo ra bào tử tự do có cấu trúc vững bền, chịu được
các điều kiện khắc nghiệt. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử lại nảy mầm tạo tế bào
sinh dưỡng 32.
1.1.2.2 Cấu tạo của bào tử
Bào tử gồm nhiều lớp bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN. Lớp áo ngoài,
lớp áo trong, vỏ bào tử, lõi.

Hình 1.2: Cấu tạo bào tử vi khuẩn.



1.2 Bacillus clausii
1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii
 Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey (1994) Bacillus clausii thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus clausii


8

 Phân bố: Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất
vườn hoặc đất sét (Bacillus clausii ATCC 31084, Bacillus clausii DSM 8716…) 27.
Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9
được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) 27.
 Hình thái: Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành
chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục.
Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm.

Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus clausii

Hình 1.4: Bào tử vi khuẩn Bacillus
clausii độ phóng đại 1000 lần

 Sinh hóa: Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein,
gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho
phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit 10 53.
 Điều kiện nuôi cấy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình
nuôi cấy cần cấp khí.
Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50ºC. Mỗi chủng sẽ có nhiệt độ thích hợp


4/4

Cephalosporin

4/4

Aminoglycosid (kanamycin, tobramycin, amikacin)

1/4 (SIN)

Macrolid

4/4

Tetracyclin

1/4 (T)

Chloramphenicol

4/4

Rifampicin

1/4 (NR)

Nhạy cảm với carbapenem, co- trimoxazole, fluoroquinolon, gentamicin,
glycopeptid, oxazolidinon, streptogramin.


Ginkid

Bào tử B. clausii

3

Bazivic

Bào tử B. clausii,
B. subtilis,
Thuốc bột
B. licheniformis, Vitamin,
taurin, lysine, calci.

4

Spobio Cl

Bào tử B. clausii

Hỗn dịch

Bioimucan

Bào tử Bacillus subtilis,
Bào tử Bacillus clausii,
Bào tử Bacillus
coagulans, beta-glucan,
taurin, lycin, cholin,
kem, B1, B2, B5, B6,


CT TNHH Dược
Phẩm
Mê Linh

 Sản xuất enzym
+ Một số chủng Bacillus clausii ví dụ: Bacills clausii KSM-K16 được sử dụng
trong sản xuất protease. Đây là một enzym quan trọng chiếm trên 65% thị trường các
enzym công nghiệp 38. Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chất
tẩy rửa, công nghiệp thuộc da…. Cũng giống như các sinh vật Bacillus khác, Bacillus
clausii KSM-K16 tiết ra protease trực tiếp vào môi trường, đặc biệt là trong thời kỳ


12

dinh dưỡng thấp, cùng với quá trình hình thành bào tử. Hoạt tính enzym protease đạt
được ở 55ºC và pH là 12,3 28 39.
 Sản xuất surfactants
Vi sinh vật Bacillus clausii 5B còn được nghiên cứu sinh tổng hợp biosurfactants
hiện đang được ứng dụng rộng lớn trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông
nghiệp và các ngành công nghiệp hóa dầu. Ưu điểm của biosurfactants là thân thiện
môi trường, độc tính thấp, phân hủy sinh học, khả năng tương thích môi trường tốt hơn,
tạo bọt nhiều hơn, tính chọn lọc cao, hoạt động cụ thể tại nhiệt độ khắc nghiệt, độ pH
và độ mặn 15.
1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B. clausii.
Trên thế giới:
+ Gabriella Casuala and Simon M. Cutting tiến hành nghiên cứu tác dụng của
Enterogermina tới thành ruột của chuột cho thấy chế phẩm Enterogmina chỉ trong thời
gian ngắn đã gây đáp ứng miễn dịch ở chuột và loại bỏ vi khuẩn gây bệnh trong thành
ruột của chuột [21].

không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [14][43].
1.3.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông
Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài
buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời
làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm [14][43].
 Giai đoạn thăng hoa
Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không.
Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp
hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua
trạng thái lỏng [14][43].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại


14

Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng
thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị
sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn
nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [14][43].
1.3.3 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp đông khô


Ƣu điểm
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng

rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác
như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo vệ
nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên
được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại


Xuất xứ

Hóa chất

Xuất xứ

Pepton

Ấn Độ

Lysozym

Viện kiểm nghiệm

Cao thịt

Merck – Đức

KH2PO4

Trung Quốc

NaCl

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc


16

- Dung dịch NaCl 0,9%: Hòa tan 9,0g NaCl trong vừa đủ 1000ml nước.
-

Ngoài ra còn 1 số dung dịch: dung dịch đỏ Fuchsin, dung dịch Xanh

methylen, dung dịch HCl 0,5%, dung dịch H2SO4 1%.
2.2.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu.
 Môi trường canh thang (MT1)

Pepton

1.0 g

Cao thịt

0.5 g

NaCl

0.5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + 1,8g thạch.
 Môi trường sản xuất bào tử (MT3) theo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.


Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy vô trùng

Bioair (Italy)

Tủ ấm

Memmert (Đức)


17

Tủ lạnh sâu

Đức

Tủ lạnh

Toshiba (Nhật)

Tủ sấy

Memmert (Đức)

Tủ lắc


2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành
bào tử của B. clausii.
2.2.2 Đánh giá đƣợc một số chỉ tiêu chất lƣợng và độ ổn định của nguyên liệu
Bacillus clausii ở dạng bột đông khô.
2.2.2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa
B. clausii.
2.2.2.2 Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở dạng bột đông khô chứa B. clausii.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.3.1 Hoạt hóa và nhân giống.
 Hoạt hóa giống từ ống giống