KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY
ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN
CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
Mai Công Minh Tâm

2
Ngày nay, khi nhắc đến lónh vực “Thụ tinh trong ống nghiệm” chúng ta đều nghó đến
những thành tựu to lớn mà nó đem lại. Ởû nước ta, việc ứng dụng “Thụ tinh trong ống nghiệm”
trong Y học nhằm giải quyết vấn đề vô sinh đã có những thành công rực rỡ, việc bệnh viện phụ
sản Từ Dũ đón chào đứa bé thụ tinh trong ống nghiệm thứ 1000. Như vậy, có thể thấy thụ tinh
trong ống nghiệm là một ngành khoa học có nhiều tiềm năng, trong đó quan trọng hơn hết nó là
một phương thức diệu kỳ nhằm khắc phục hiện tượng bất thụ của con người nói riêng cũng như
động vật nói chung. Tuy nhiên để đạt được những thành công to lớn ấy, việc đầu tư nghiên cứu
những quy trình mới cũng như việc tìm tòi sáng tạo cải tiến quy trình cũ nhằm đưa ra một quy
trình hợp lý mang tính thực tiễn cao thích hợp với điều kiện nước ta là vô cùng cấp thiết. Ngày
nay đối tượng được sử dụng rộng rãi nhất trong lónh vực này đó là chuột nhắt trắng bởi vấn đề
đạo đức trong sinh học không cho phép chúng ta nghiên cứu trên con người.
Trong bước đầu tiếp cận với quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở chuột nhắt trắng,
chúng tôi đã gặp không ít khó nhăn do điều kiện của chúng ta còn nhiều hạn chế. Nhưng thông
qua đó, chúng tôi dần hoàn thiện thao tác của mình nhằm phù hợp với điều kiện hiện có. Và
thông qua đó, chúng tôi nhận thấy rằng: “Nếu như chúng ta gia tăng thời gian cấy trứng thì
chúng ta sẽ giảm thiểu thời gian hợp tử tồn tại trong môi trường ngoài, hơn nữa các chi phí tốn
kém về môi trường nuôi cấy, đóa petri nuôi cấy và các thành phần khác sẽ được giảm thiểu.
Ngoài ra, việc xác đònh chính xác những phôi đã thụ tinh (phôi 2 tế bào) sẽ dễ dàng hơn.”
Trong gần 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống
nghiệm Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện đề tài này và đã thiết lập những thí

 Kim tiêm 26G
 Đóa petri nhựa (đường kính 35 mm)
 Đóa petri nhựa (đường kính 60 mm)
 Pipette Pasteur vô trùng.
 Dụng cụ hút, rửa phôi
2.1.3) Dụng cụ đếm tế bào :
 Lame, lamelle
 Phòng đếm Neubauer
2.1.4) Những dụng cụ khác :
 Đèn cồn.
 Tip 10 – 100 µl
 Micropipette 10 – 100 µl .
Mai Công Minh Tâm

4
 Gói Medipack dùng để đóng gói dụng cụ phẫu thuật trước khi hấp vô
trùng.
2.2) Hoá chất :

2.2.1) Hoá chất khử trùng:
 Cồn 70
0
.
2.2.2) Hormon kích thích trứng chín và rụng:
PMSG : - Dạng đông khô.
- Bảo quản : 25
0
C, tránh ánh sáng.
- Công dụng : kích thích nang trứng phát triển.
- Pha chế : stock 1000UI + 10 ml nước cất 2 lần

Mai Công Minh Tâm

5
Thành phần chính :
¾ Muối
¾ Lactate
¾ Pyruvate
¾ Human serum albumin _ HSA
¾ Nước Mili Q.
2.2.5) Dầu phủ môi trường :
Dầu khoáng do phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm Bệnh viện phụ
sản Từ Dũ cung cấp.
- tỷ trọng 0.83 – 0.86 ở 20
o
C
- khử trùng dầu bằng phương pháp lọc bằng milipore filter.
II. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm:
 Các phương pháp được thực hiện như sau :
1) Ổn đònh điều kiện sống của chuột khoảng 2 – 3 ngày trước khi làm thí nghiệm.
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn đònh trong chuồng bằng thuỷ tinh có thể tích 25cm
° 25 cm ° 12 cm tại phòng nuôi chuột thí nghiệm – Khoa Hiếm muộn bệnh viện
Phụ sản Từ Dũ.
Chuột đực và chuột cái được nuôi riêng. Một chuồng có khoảng 3 con. Chuột
được ổn đònh chu kỳ sáng tối chu kỳ sáng 7 giờ đến 19 giờ, chu kỳ tối từ 19 giờ đến 7
giờ sáng hôm sau.
Thức ăn dùng để nuôi chuột là cám viên chuyên biệt cho chuột của viện Pasteur,
cùng với giá, rau muống, thóc mầm. Cách cho chuột ăn như sau :
 Sáng : cho chuột ăn cám viên.
 Chiều : cho chuột ăn thóc mầm hoặc giá hay thỉnh thoảng cho chuột ăn
rau muống.

 Toàn bộ dụng cụ giải phẩu chuột đều được đóng gói lại cẩn thận và đem hấp khử
trùng bằng autoclave ở 121
o
C khoảng 30 phút trước khi sử dụng.
 Chuẩn bò một đóa rửa (R) : dùng để rửa trứng sau khi thu và làm nơi để trứng chờ
trước khi thụ tinh. Trong đó, 3 giọt đầu (1,2,3) chứa khoảng 80 µl môi trường
Gamete và một giọt còn lại chứa 80 µl môi trường IVF. Sau đó, phủ ngập dầu
khoáng đóa rửa này và ủ trong tủ ấm ở 37
0
C, 5% CO
2
.
 Chuẩn bò 4 ống tuýp loại 5ml trong đó :
Ngày thực hiện Chuột dùng để thu phôi
Ngày - 3 (D
-3
) Tiêm 10 IU PMSG cho chuột cái
Ngày -1 (D
-1
)
(46 – 48h sau khi tiêm PMSG)
Tiêm 10 IU Pregnyl.
Mai Công Minh Tâm

7

 C
h
u
a

SP1 Gamete 2 ml Thu mào tinh và rửa sạch máu, mỡ.
SP2 IVF 1 ml Thu tinh trùng
OV1 Gamete 2 ml Thu ống dẫn trứng và rửa sạch máu, mỡ.
OV2 Gamete 2 ml Thu trứng
1 2
3 4
80 µl IVF
80 µl Gamete
80 µl Gamete
Hình 16 : Chuẩn bò đóa rửa trứng.
Mai Công Minh Tâm

8 Hình 17 : Thao tác tạo giọt môi trường và chuyển phôi vào giọt môi trường.
3.3 Những chuẩn bò trước khi thao tác vào ngày D
0

bất lợi cho thao tác sau này.
- Chuyển mào tinh hoàn vào ống tuýp SP1.
3.4.2 Thu nhận tinh trùng và xác đònh mật độ tinh trùng :
- Chuyển toàn bộ môi trường chứa mào tinh trong ống SP1 vào một đóa petri vô
trùng đã chuẩn bò trước.
- Dùng 2 ống tiêm đã chuẩn bò trước rửa sạch máu và loại bỏ mỡ bám trên mào
tinh.
- Chuyển toàn bộ môi trường trong ống tuýp SP2 vào đóa petri đã chuẩn bò trước.
- Chuyển mào tinh này sang đóa trên. Dùng 2 ống tiêm đẩy tinh trùng ra khỏi mào
tinh hoàn. Để thu được lượng tinh trùng triệt để trong mào tinh, ta có thể dùng
đầu ống tiêm trên tạo một vài vết cắt trên mào tinh rồi ấn nhẹ vào mào tinh để
tinh trùng thoát ra dễ dàng. Cứ thế ta sẽ thu được từng khối tinh trùng trào ra từ
những vết cắt.
- Dùng ống tiêm có đầu silicon đã gắn sẵn pipet pasteur thu tất cả môi trường chứa
tinh trùng vào một ống tuýp mới. Tiếp theo ta trộn đều môi trường chứa tinh
trùng bằng cách hút nhả nhiều lần môi trường này. Chú ý thao tác thật nhẹ
nhàng nếu không lực cơ học khi hút đẩy sẽ làm chết tinh trùng chuột. Sau đó,
trích một ít môi trường để xác đònh mật độ tinh trùng bằng phương pháp phòng
đếm Neubauer.
3.4.3 Xử lý tinh trùng và xác đònh mật độ tinh trùng sau xử lý:
Mai Công Minh Tâm

10
- Sau khi xác đònh mật độ tinh trùng lúc ban đầu. Ta xử lý tinh trùng bằng phương
pháp Swim – up.
- Nguyên tắc của phương pháp này được trình bày ở phần tổng quan tài liệu.
Cách tiến hành :
- Dùng ống tiêm đã dùng ở trên hút trộn môi trường chứa tinh một lần nữa.
- Chia đôi môi trường này.
- Chuyển từng phần môi trường chứa tinh trùng (khoảng 0,5 ml) đặt nhẹ nhàng bên

3.5 Thu nhận trứng :

3.5.1 Giải phẫu chuột cái và thu ống dẫn trứng:
 Giết chuột đột ngột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ.