ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THANH BÌNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA
TRONG VIỆC ĐỊNH HƢỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT
CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT
TRÚNG ĐÍCH UNG THƢ

Ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số ngành: 62420104
Khóa học năm: 2015
Xác nhận của Cán bộ hướng dẫn:

TS. Phạm Văn Phúc


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THANH BÌNH

ĐỀ CƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA
TRONG VIỆC ĐỊNH HƢỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT
CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT TRÚNG

đặc hiệu nên có thể sử dụng trong điều trị ung thư để loại bỏ khối u mà không tác động
lên các tế bào bình thường. Liệu pháp miễn dịch nhắm đến việc tăng cường đáp ứng miễn
dịch của cơ thể đối với khối u (miễn dịch chủ động) hay cung cấp các kháng thể hoặc các
tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên khối u (miễn dịch thích ứng-adoptive
immnunotherapy) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2012; Dougan & Dranoff, 2012; Rescigno,
Avogadri, & Curigliano, 2007; Smith, Oertle, & Prato, 2014; Vanneman & Dranoff,
2012).


Tế bào tua (dendritic cell – DC) là tế bào miễn dịch có chức năng trình diện kháng
nguyên. Chúng có khả năng hoạt hóa tế bào T trợ giúp CD4 trinh nguyên và tế bào T gây
độc CD8 (cytotoxic T lymphocyte – CTL) chưa được cảm ứng. Đây được xem là một
hướng tiếp cận liệu pháp miễn dịch chủ động, nghĩa là liệu pháp dựa vào tế bào DC được
sử dụng nhằm tạo các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt của khối u và tạo ra
đáp ứng tế bào T gây độc tiêu diệt tế bào ung thư (Barth et al., 2010; Gilboa, 2007;
Kalinski & Okada, 2010; Lesterhuis et al., 2011; Steinman, 2012). Trên thế giới, nghiên
cứu điều trị ung thư vú bằng tế bào tua đã tiến đến bước thử nghiệm lâm sàng; tuy nhiên,
hiệu quả đẩy lùi căn bệnh ung thư còn thấp vì những lý do sau: (i) DC cần nguồn kháng
nguyên ung thư chuyên biệt và quan trọng trong việc cảm ứng tế bào hiệu quả tiêu diệt
khối u, trong khi khía cạnh này dù rất nỗ lực nhưng các nhà khoa học chỉ mới xác định
được một số ít kháng nguyên ung thư; (ii) DC là tế bào trình diện kháng nguyên nên
chúng chỉ có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch kháng u mà không có chức năng
thực hiện trực tiếp công việc này, nên với hệ miễn dịch bị ức chế trong cơ thể bệnh nhân
ung thư gây ra bởi chính các cơ chế bảo vệ của tế bào ung thư và/hay từ chính các
phương pháp điều trị như hóa trị, xạ trị làm các tế bào miễn dịch trở nên dung nạp, đây là
nguyên nhân dẫn đến hiệu quả của liệu pháp DC vẫn còn thấp. Vì vậy việc kết hợp liệu
pháp sử dụng DC và các tế bào miễn dịch kháng u khác ngày càng có ý nghĩa không chỉ
về mặt nghiên cứu mà còn trên mặt thực tiễn lâm sàng.
Liệu pháp miễn dịch thích ứng là liệu pháp cá thể hóa tiêm truyền các tế bào miễn
dịch kháng u của bệnh nhân được nuôi cấy ex vivo để tiêu diệt tế bào ung thư, đây là một

quả và ít tác dụng phụ hay không? Đề tài hướng đến giải quyết các mục tiêu
sau:
2.1.

Khảo sát hiệu quả tiêu diệt trúng đích tế bào ung thư in vitro bằng các liệu
pháp DC, CIK và kết hợp DC/CIK.

2.2.

Xác định cơ chế tác động và vai trò của DC trong việc định hướng tế bào
CIK tiêu diệt tế bào ung thư vú in vitro.

2.3.

Nghiên cứu được hiệu quả điều trị của liệu pháp DC-CIK đồng loại trên mô
hình chuột mang khối u vú.


3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng
Dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1 được sử dụng để thiết lập dòng tế bào ung thư vú 4T1
kháng thuốc điều trị ung thư doxorubicin.
Dòng tế bào thường (nguyên bào sợi chuột) được phân lập từ chuột BALB/c khỏe mạnh
bằng phương pháp nuôi cấy sơ cấp biểu bì. Nguyên bào sợi được tăng sinh trong môi
trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh/nấm. Tế bào được sử dụng từ
lần cấy chuyền thứ 3-7, đồng thời được lưu trữ trong ni tơ lỏng đến khi có nhu cầu sử
dụng.
Chuột BALB/c khỏe mạnh, cân nặng 25-30 gram, 8-10 tuần tuổi được sử dụng để thu
nhận các nguồn tế bào máu đơn nhân để nuôi cấy tế bào CIK và DC, và được gây mô
hình mang khối u vú được thiết lập từ dòng tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc.



Chọn lọc các tế bào từ lô thí nghiệm có sự kháng doxorubicin cao nhất, tiến
hành nuôi cấy ổn định các tế bào này trong môi trường có bổ sung nồng độ
thuốc tương ứng (đến lần cấy chuyền thứ 3) và sử dụng chúng làm nguồn tế
bào cho các thí nghiệm tiếp theo.
-

Tạo được dòng tế bào ung thư vú kháng thuốc mang gen chỉ thị huỳnh quang
gfp, bằng cách sử dụng lentivirus. Đánh giá và chọn lọc dòng tế bào mang gen
chỉ thị mà vẫn không thay đổi tính kháng thuốc.

-

Chuột cái BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng 25–30 gram được mua
từ Charles Rivers (Sulzfeld, Đức). Chuột được nuôi trong điều kiện sạch
khuẩn, tiến hành thí nghiệm dựa trên Quy tắc thí nghiệm trên động vật (PTN.
Tế bào gốc).

-

Tạo chuột mô hình mang khối u vú 4T1 kháng thuốc:
+ Tế bào được huyền phù trong dung dịch PBS mật độ 1x106 tế bào/ml.
+ Thao tác trong phòng vô trùng, xác định vùng vú của chuột, tiến hành cạo
sạch lông, sát khuẩn. Chuẩn bị kim tiêm vô trùng, tiêm dưới da 0,1 ml huyền
phù tế bào 4T1 kháng thuốc trong PBS vào vùng mỡ vú chuột.
+ Theo dõi và ghi nhận kích thước khối u trong 7 ngày ghép tế bào ung thư.
3.2.2. Phương pháp thu nhận và biệt hóa tế bào CIK từ gan và lách
chuột và tế bào DC từ tủy xương chuột


-

Đồng nuôi cấy tế bào DC và CIK:
Tế bào CIK và DC được thu nhận và nuôi cấy theo quy trình trên. Sau khi DC
được cảm ứng với dịch ly giải tế bào 4T1 kháng thuốc (D9), DC được thu nhận
và đồng nuôi cấy với CIK thêm 5 ngày nữa.
Khảo sát tác động của DC lên đặc điểm tế bào CIK với 2 hình thức nuôi cấy:
+ Đồng nuôi cấy tiếp xúc
+ Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert)
3.2.3. Phương pháp xét nghiệm apoptosis/necrosis
Nguyên tắc: Annexin V và propidium iodide (PI) là hai thuốc nhuộm giúp
phân biệt giữa tế bào bị hoại tử (necrosis) hay chết theo lập trình (apoptosis).
Phân tích sự gắn annexin V dựa vào sự chuyển vị của phosphatidylserine từ
màng trong ra màng ngoài do sự bất ổn định của màng trong quá trình
apoptosis. Khi gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang như FITC có thể phát hiện tế
bào bị apoptosis trong giai đoạn sớm. PI là thuốc nhuộm nhân khi màng tế bào
mất đi tính nguyên vẹn, nên khi tế bào bị apoptosis muộn/necrosis thì PI đi vào
nhân.
+ Tế bào sống: Annexin V- và PI+ Tế bào trong giai đoạn apoptosis sớm: Annexin V+ và PI-


+ Tế bào trong giai đoạn apoptosis muộn và necrosis: Annexin V+ và PI+
3.2.4. Các phương pháp đánh giá đặc điểm tế bào miễn dịch
-

Phương pháp flow cytometry:
+ DC được đánh giá khả năng trưởng thành bằng các kháng thể đơn dòng
kháng CD14/CD40/CD80/CD83/CD86/HLA-DR.
+ CIK được đánh giá khả năng hoạt tính bằng các kháng thể đơn dòng kháng
CD3/CD56/NKG2D và perforin/granzyme B.


-

Khảo sát tác động tiêu diệt trúng đích của tế bào miễn dịch: các lô thí nghiệm
tương tự đối với tế bào ung thư, nhưng tế bào đích được thay thế bằng nguyên
bào sợi chuột.

-

Phương pháp đo thực thời dựa vào điện trở:
Phương pháp này sử dụng hệ thống xCelligence được phát triển bởi Roche và
ACE Biosciences để ghi nhận sự tăng sinh tế bào thực thời. Các tế bào được
cấy lên một đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với các vi điện cực bằng vàng được
bao phủ dưới lớp đáy. Về nguyên tắc: càng nhiều tế bào bám dính vào đáy
giếng, thì trở kháng của điện cực s càng tăng phản ánh thông qua chỉ số tế bào
(cell index-CI), theo các quy tắc sau:
+ Khi không có tế bào, hoặc tế bào không bám dính vào điện cực ở đáy, chỉ số
CI bằng 0
+ Trong cùng điều kiện sinh lý, càng nhiều tế bào bám, chỉ số CI càng lớn.
+ Hơn nữa, sự thay đổi trạng thái tế bào như hình thái, sự bám trải, sức sống s
dẫn đến sự thay đổi CI.

Điểm ưu việt của hệ thống này chính là khả năng ghi nhận số liệu thực thời chính
xác đến từng phút, cho phép theo dõi sự tăng sinh tế bào, sự ảnh hưởng của các tác
nhân lên tế bào mà không cần phải can thiệp trực tiếp vào tế bào như các phương
pháp khác như MTT, BrdU.
Phương pháp này cho phép xác định liệu pháp miễn dịch hiệu quả trong việc tiêu
diệt tế bào ung thư 4T1 với tỷ lệ tế bào đích:tế bào miễn dịch tương ứng.
3.2.6. Phương pháp đánh giá hiệu quả liệu pháp DC, CIK và liệu pháp
kết hợp trong điều trị mô hình chuột ung thư vú


-

Phân tích thành phần tế bào miễn dịch (bằng phương pháp flow cytometry)
trong máu ngoại vi chuột (1 lần/tuần). Chuột được theo dõi các chỉ tiêu sinh lý
quan sát và đo đạc được: cân nặng, biểu hiện bên ngoài (lông, mắt...), tình
trạng tiêu hóa.

-

Khảo sát sự sống sót/tồn tại/di căn của tế bào ung thư bằng hệ thống phân tích
hình ảnh chuột (Xenogen IVIS Spectrum In Vivo Imaging System), 2 lần/tuần.

-

Sau 30 ngày ghép tế bào miễn dịch. Tiến hành mổ chuột, xác định, thu nhận
khối u còn lại. Cắt lát mô, nhuộm H&E và/hay hóa mô miễn dịch xác định sự
tồn tại của tế bào ung thư, sự xâm nhập tế bào miễn dịch vào khối u. Kiểm tra
sự hiện diện các tế bào miễn dịch trong các cơ quan: gan, lách... sau khi điều trị
ở chuột (bằng phương pháp flow cytometry).
3.2.7. Phương pháp xử lý thống kê

Tất cả thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
giữa các giá trị trung bình được xử lí và phân tích bằng Student s t-Test ANOVA
và GraphPad Prism 6. Khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
4. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu
4.1. Nội dung 1: Khảo sát hiệu quả tiêu diệt trúng đích tế bào ung thư in vitro
bằng các liệu pháp DC, CIK và kết hợp DC/CIK
-


tương tự đối với tế bào ung thư, nhưng tế bào đích được thay thế bằng nguyên
bào sợi chuột.

4.2.

Nội dung 2: Xác định cơ chế tác động và vai trò của DC trong việc định
hướng tế bào CIK tiêu diệt tế bào ung thư vú in vitro

-

Khảo sát tác động của DC lên đặc điểm tế bào CIK với 2 hình thức nuôi cấy:
+ Đồng nuôi cấy tiếp xúc
+ Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert)

-

Đánh giá tỷ lệ tế bào sống sau quá trình nuôi cấy ở các lô DC, CIK và
CIK/DC: sử dụng phương pháp flow cytometry đánh giá tỷ lệ tế bào biểu hiện
Annexin V/PI.


-

Đánh giá kiểu hình (thụ thể/đồng thụ thể đáp ứng miễn dịch) của các lô nuôi
cấy DC, CIK và CIK/DC bằng phương pháp flow cytometry.

-

Đánh giá chức năng (tiết cytokine) các lô nuôi cấy DC, CIK và CIK/DC bằng
phương pháp ELISA.

hình ảnh chuột (Xenogen IVIS Spectrum In Vivo Imaging System).

-

Sau 30 ngày ghép tế bào miễn dịch. Tiến hành mổ chuột, xác định, thu nhận
khối u còn lại. Cắt lát mô, nhuộm H&E và/hay hóa mô miễn dịch xác định sự
tồn tại của tế bào ung thư, sự xâm nhập tế bào miễn dịch vào khối u. Kiểm tra
sự hiện diện và tỷ lệ các loại tế bào miễn dịch trong các cơ quan: gan, lách...
sau khi điều trị ở chuột.

5. Dự kiến kết quả đạt đƣợc (kết quả nghiên cứu, bài báo khoa học)
Kết quả nghiên cứu giải quyết được mục tiêu của đề tài rằng việc kết hợp với DC
giúp định hướng cho tế bào CIK tiêu diệt trúng đích ung thư, hiệu quả và ít tác
dụng phụ.
Trong thời gian thực hiện luận án có ít nhất 2 công bố quốc tế liên quan đến nội
dung luận án tiến hành.
6. Nơi thực hiện đề tài


Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào Gốc – Trường ĐH KHTN –
ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh
B2-3, cơ sở Linh Trung, Tp. Hồ Chí Minh
7. Phân bố thời gian thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện là 3 năm
8. Tài liệu tham khảo
Abbas, A. K., Lichtman, A. H., & Pillai, S. (2012). Cellular and molecular immunology.
Philadelphia: Elsevier/Saunders.
Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., & Clarke, M. F. (2003).
Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S
A, 100(7), 3983-3988. doi: 10.1073/pnas.0530291100

Rescigno, M., Avogadri, F., & Curigliano, G. (2007). Challenges and prospects of
immunotherapy as cancer treatment. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on
Cancer, 1776(1), 108-123.
Smith, A. J., Oertle, J., & Prato, D. (2014). Immunotherapy in Cancer Treatment. Open
Journal of Medical Microbiology, 4(03), 178.
Steinman, R. M. (2012). Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu Rev
Immunol, 30, 1-22. doi: 10.1146/annurev-immunol-100311-102839
Vanneman, M., & Dranoff, G. (2012). Combining immunotherapy and targeted therapies in
cancer treatment. Nature reviews cancer, 12(4), 237-251.
Videtic, G. M. (2012). Locally advanced non-small cell lung cancer: what is the optimal
concurrent chemoradiation regimen? Cleve Clin J Med, 79 Electronic Suppl 1, eS3237. doi: 10.3949/ccjm.79.s2.07