146
Chương 5

Công nghệ chuyển gen ở Thực vật I. Khái niệm chung
Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử
dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể
thực vật tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn. Phương
pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang
nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên, phép lai chéo này bị hạn chế bởi
nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai
giữa những các thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không
thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời
gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường
những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ
hàng gần nhau.
Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng
lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc
từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần
nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này
cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn
và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống.
Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều
gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai
tạo như trước đây. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể
được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ
những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là thực vật
“chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển

tiết ra từ cây chuyển gen.
- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không
phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh
thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây
chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có
giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được.
Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những
vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông
tin tin cậy và có cơ sở khoa học. 148
Cuối cùng, vì tầm quan trọng của lương thực thực phẩm cho
con người, nên các chính sách liên quan tới cây chuyển gen sẽ phải
dựa trên những cuộc tranh luận cởi mở và trung thực có sự tham gia
của mọi thành phần trong xã hội.

Khái niệm về thực vật chuyển gen
1.
Muốn tạo một sinh vật biến đổi gen (genetically modified
organism-GMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA
ngoại lai (foreign DNA) vào trong tế bào của chúng. Ở vi khuẩn, tế
bào được xử lý bằng dung dịch muối calcium chloride. Ở tế bào nấm
men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tế bào tiếp xúc với lithium
chloride hoặc lithium acetate. Tuy nhiên, đối với phần lớn sinh vật
bậc cao cần phải có các phương pháp khác tinh vi hơn.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của
các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nó đã trở thành phương
tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật. Ngoài

- Những đặc điểm không mong muốn của thực vật. Chẳng hạn,
sự tổng hợp các chất độc hoặc chất gây dị ứng có thể được loại trừ
bằng công ng
hệ gen.
- Thực vật biến đổi gen có thể là lò phản ứng sinh học
(bioreactor) sản xuất hiệu quả các protein và các chất cần thiết dùng
trong dược phẩm và thực phẩm..
- Mở ra khả năng nghiên cứu chức năng của gen trong quá
trình phát triển của thực vật và các quá trình sinh học khác. Vì vậy,
thực vật biến đổi gen có ý nghĩa trong nghiên cứu cơ bản.
- Trong lai tạo giống hiện đại, công nghệ gen giúp làm giảm sự
mâu thuẫn giữa kinh tế và môi trường sinh thái. Bằng việc sử dụng
cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể giảm được lượng thuốc bảo vệ
thực vật.
Mục đích của nông nghiệp hiện đại không chỉ là tăng năng suất
mà còn hướng đến những lĩnh vực quan trọng sau:
+ Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity).
+ Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các
điều kiện bất lợi).
+ Nâng cao chất lượng sản phẩm.
+ Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng.
+ Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học.
+ Tạo ra sản phẩm không gây hại môi trường.

2. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật
Lịch sử phát triển công nghệ gen của thực vật chắc chắn có rất
nhiều sự kiện quan trọng
. Ở đây chỉ nêu lên những mốc có ý nghĩa
đặc
biệt nhằm làm rõ sự phát triển rất nhanh của lĩnh vực này:

kháng côn trùng đã làm cho công ng
hệ gen đạt được một bước phát
triển quan trọng hơn. Một thành công quan trọng khác là đã điều
khiển
được quá trình chín ở cà chua, sau này có tên là FlavrSaver.
Năm 1994, lần đầu tiên cà chua biến đổi gen được bán trên thị
trường.
- Năm 1989, không những đã thành công trong việc chuyển các
gen mã hóa các kháng thể vào thực vật, mà
người ta còn tạo nên các
sản phẩm gen này như mong muốn. Kết quả này đã mở ra một khả
năng hoàn toàn mới mẽ cho việc sản xuất vaccine và cả khả năng
chống bệnh ở thực vật.
- Năm 1990, thành công trong việc tạo ra cây biến đổi gen bất
dục đực, không có khả năng tạo hạt phấn. Loại cây trồng này có ý
nghĩa lớn trong việc sản xuất hạt giống. 151
- Từ năm 1991, thành phần carbohydrate của thực vật được
biến đổi và năm 1992 là các acid béo. Cùng năm đó, lần đầu tiên
thành phần alkaloid ở một loại cà được cải thiện, là một bước quan
trọng đối với thực vật trong việc tổng hợp nhóm hợp chất này.
Những thực vật này có ý nghĩa lớn đối với việc thu nhận dược liệu.
Sau khi thực vật biến đổi gen này xuất hiện, chất nhân tạo phân giải
sinh học được tổng hợp. Điều này cho phép chúng ta hy vọng rằng,
trong tương lai sẽ có những thực vật có đặc tính mới, được sử dụng
như là các bioreactor thực vật để sản xuất “nguyên liệu tái sinh”.
- Năm 1994, cà chua Flavr Savr
R
152
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái
sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome.
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác
nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả
năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp
có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở
nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp
và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài,
kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì
thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose
thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành
tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi
tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ
với sự
biểu hiện tạm thời của gen.
- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật
chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome.
- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào
kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào.
- Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genom cây
chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế
bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem).

2. Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen

(pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ
thuật chuyển bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc
đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối
với cây chuyển gen ở thực vật.
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ
thư viện genomic DNA).
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.
- Biến nạp vào E. coli.
- Tách chiết DNA plasmid. 154
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các
phương pháp khác nhau đã kể trên.
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern
blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot,
Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...).
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật
riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là
thành tế bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường
sử dụng enzyme và dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể
tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng.
Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, ở đây tế bào được đặt ở
trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể làm xuất hiện những
lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào

1. Các hướng nghiên cứu
Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gen ở thực
vật đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay, các phòng thí nghiệm công
nghệ gen đang bắt tay vào việc cải thiện các đặc điểm di truyền cho
một số loài cây trồng có giá trị nhờ các công cụ của sinh học tế bào
và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương,
lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gen bị giới hạn bởi
genotype. Một số các cây trồng quan trọng khác, cần thiết cho nhu
cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển hiện cũng ít
được chú ý.
Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định.
Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gen; mặc dù một vài
vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại, nhưng chúng đang từng bước
được giải quyết. Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một
phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các tính
trạng đa gen (multigenic traits). Một điều không thể quên là vấn đề
nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi
trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ DNA tái tổ hợp
(DNA recombinant technology) mang lại. Hiện nay, công nghệ
chuyển gen đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của
các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation
(Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều đó
là cần phải xác định
một phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến
nạp gen mang lại đến các nước đang phát triển.
Cây biến nạp gen đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này
cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của
công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều
cho các nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng


(bacteriophage T
4
) đưa vào cây thuốc lá và
khoai tây. Các gen này biểu hiện hoạt tính lysozyme mạnh và các tế
bào có khả năng phòng trừ vi khuẩn Erwina carotovora rất tốt.
- Gen mã hóa α-thionin-cystein được chuyển giao sang cây
thuốc lá cũng phòng ngừa được vi khuẩn Pseudomonas syringae.
- Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố của vi khuẩn là
hướng có nhiều hứa hẹn. Gen này chủ yếu là gen sản xuất các loại
enzyme phân hủy độc tố của vi khuẩn, do vậy vô hiệu hóa tác hại
của chúng.