94
Chương 3

Các phương pháp xác định sự hiện diện
và biểu hiện của gen ngoại lai I. Southern blot
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của
Sinh học phân tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting,
phương pháp lai Southern hay phương pháp lai DNA .
Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả
năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong
các nghiên cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950
và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố định không được phân đoạn, chỉ
đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai
nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu
thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn
chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ
đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn
DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. Phương pháp này
được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975.
Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả. Mặc dù đã được
cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng thí
nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương
pháp ban đầu.
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
- Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
- Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên

sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.
Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự hiện
diện, kích thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng của DNA trong
một phức hợp. Ví dụ, Southern blot có thể được sử dụng để phát
hiện một gen đặc biệt ở trong một genome nguyên vẹn.

II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào
năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định
các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot. Phương pháp này còn
được gọi là Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương
pháp lai RNA.
Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách
bằng điện di trên gel agarose. 96 Hçnh 3.1: Så âäö mä taí phæång phaïp Southern
blot

- RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai
(các phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel).
- RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi
đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một

97
enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành

Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-
PAGE.
- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose,
giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.
- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ
cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu,
sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối
với protein quan tâm.
- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp
(secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc
horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào
kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.
- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc
hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ
phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-

99
kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở
bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.
- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát
hiện các điểm sáng phát ra do enzyme. Hình 3.3: Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot

IV. ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở
thành một phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan