Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

HÀ ÁNH NGỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢ NĂNG
LÊN MEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẶT
TRONG MỒI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG
TẢO XOẮN (SPIRULINA sppO

Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC Người hướng dẫn
khoa học: PGS. TS. Đỉnh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2016


Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ, tôi đã nhận
được những lời chi bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị em và các
bạn. Với lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn tới:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động
viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận vãn.
Tôi xỉn chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2. Bên
cạnh đổ, Ban giảm hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã
tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ của Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình chụp ảnh mẫu để hoàn thành nghiên cứu của
mình.
Cảm ơn cán bộ Sở khoa học công nghệ - Tỉnh Vĩnh Phúc đã giúp đỡ tôi phân tích

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men củacác chủng vi sinh vật tuyển
chọn


Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên mencủa các chủng vi
sinh vật tuyển chọn.....................................................................................59
Bảng 3.21. Đánh giá chất lượng sản phẩm nước giải khátbằng phương pháp
cảm quan.....................................................................................................67
BẢNG CHỮ CÁI VIÉT TẮT TRONG LUẬN VĂN

1. TCN
2. VK

: Trước công nguyên
: Vi khuẩn

3. NM
4. TCVN

: Nấm men
: Tiêu chuẩn Việt Nam

5. MT
6. TP

: Môi trường
: Thành phố

7. Nxb


tài “Công nghiệp nuôi trồng và và xử lý tảo Spirulina”. Tuy nhiên, sản phẩm này chỉ mới phát triển ở những năm gần đây và
chua có đề tài nghiên cứu quá trình lên men trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn. Vì vậy, việc nghiên cứu quá trình lên men
dịch tảo xoắn từ đó ứng dụng vào ché biến nuớc giải khát tảo xoắn, sẽ góp phần làm phong phú các sản phẩm nuớc uống trên
thị truờng và tận dụng các ích lợi từ nguồn duợc liệu này đến nguời tiêu dùng, chính vì vậy tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân
lập và khả năng lên men của một số chủng vi sinh vật trong môi trường có bổ sung tảo xoắn (Spirulina spp.)”
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đuợc chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn
(Spirulina spp.).

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn
(Spiruỉina spp.)

3.2. Tuyển chọn đuợc chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo
xoắn (Spirulina spp.)
3.3. Ảnh huởng của môi truờng dinh duỡng tới quá trình lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn
(Spiruỉina spp.)

3.4. Ảnh huởng của điều kiện lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn (Spirulỉna spp.)
ứng dụng để lên men tạo đồ uống trong môi truờng có bổ sung tảo xoắn {Spirulina spp.)


9

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic, nấm men
tuyển chọn từ môi trường lên men có bổ sung tảo xoắn (Spỉrulỉna spp.)
4.2. Phạm vi nghiên cứu: chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng lên men tạo
nước giải khát trong môi trường bổ sung tảo xoắn (iSpiruỉina spp.)
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn


Tảo lam hay còn gọi là vi khuẩn lam theo tiếng Hi Lạp thì cyanos-blue là một
ngành vi khuẩn mà có khả năng hấp thu năng lượng qua quá trình quang hợp. Tảo xoắn


1
0

(Spiruỉina spp.) là vi khuẩn lam dạng sợi thuộc ngành vi khuẩn lam hay tảo lam. Tảo

xoắn (Spiruỉina spp.) là một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò so, màu xanh lam với kích
thước chỉ khoảng 0,25 mm. Chúng sống trong môi trường giàu bicarbonate (HCO 3") và
độ kiềm cao (pH 8,5-9,5). Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trị dinh dưỡng cao.
Do hình thái “lò so xoắn” dễ nhận biết qua kính hiển vi, người ta cũng thường gọi tảo
này là “tảo xoắn”. Tảo (Spỉrulỉna spp.) vẫn tiếp tục được nghiên cứu sử dụng như thức
ăn -vị thuốc trong tương lai do khả năng phát triển cực kỳ nhanh của một vi sinh vật
đơn bào. Tảo (Spiruỉinaspp.) xuất hiện cách đây hơn 3 tỷ năm. Nó là vi khuẩn lam cố
định có lịch sử lâu đời hơn tảo nhân thật hoặc thực vật bậc cao tới 1 tỷ năm. Hơn 1
ngàn năm trước tổ tiên của những người Aztect ở Mexico đã biết thu hái (Spỉrulina
spp.) từ các hồ kiềm tính, phơi dưới ánh nắng mặt ữời và dùng làm thực phẩm. Tên gọi
(Spỉrulỉna spp.) do nhà tảo học Deurben (người Đức) đặt năm 1927, dựa trên hình thái

của tảo là dạng sợi xoắn ốc (spiralis) [23],
1.1.2.

Đặc điểm sinh học của tảo xoắn (Spirulina spp.)

1.1.2.1.

Phân loại

chất dinh dưỡng do các luồng nước chính tạo ra gặp vùng đất rộng có thể làm hình
thành các vùng tăng trưởng thường xuyên cho quần lạc thực vật phù du này là cơ sở của
mạng lưới thực phẩm và hỗ trợ cho mọi sự sống dưới nước thuộc hình thái cao hơn. Tại
các hồ cấy vi tảo người ta không cần đất màu. Tuy nhiên do vi tảo phát triển với tốc độ
lớn như vậy, nên phải cung cấp chất dinh dưỡng nhanh hơn so với cây trồng trên cạn.
Phải bơm xuống nước đủ lượng C0 2 và phải luôn luôn cung cấp chất dinh dưỡng có khả
năng hòa tan khác để các hồ luôn luôn có vi tảo được thu hoạch [8], [23].
1.1.3.

Giá trị dinh dưỡng và công dụng của tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

1.1.3.1.

Giá trị dinh dưỡng của tảo xoan (Spirulina spp.)

Spirulina còn có tên thương mại là Arthrospỉra platensỉs mà được nuôi trồng

trên thế giới như một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu chất dinh dưỡng. Hiện nay được
phổ biến như là thực phẩm bổ dưỡng tại us và Europe.
Protein: 55%-70%
Giàu các vitamin: vitamin A, Bi, B2, B3, B6, B12, vitamin c, vitamin D, vitamin
E, folate, vitamin K, biotin, axit pantothenic, beta carotene - tiền chat của vitamin A,
inositol.
Giàu các chất khoáng: Canxi, mangan, sắt, chromium, photpho, magie, selen.
Giàu các sắc tố: phycoxyanin, chlorophyll,carotenoid và xanthophyll và các sắc
tố khác.
Các hợp chất hữu cơ: Axit gama linoleic, glycolipid, các pholysaccharide.


1


2,16 %
0,99 %

Cu
Fe
K

6,1 mg/kg
0,074 %

Zn
Chất béo
Protein

30,4 mg/kg
5,43 %
62,1 %

Mg

0,36 %

1.1.3.2.

1,87 %

Câng dụng của tảo xoắn (Spiruỉina spp.)

> Proteỉn chất lượng cao

cho người ăn kiêng. Đối với những người suy dinh dưỡng, cần tăng trọng cách tốt nhất
là bổ sung Spirulỉna spp. sau mỗi bữa ăn. Chất dinh dưỡng sẽ được tích lũy lại, giúp
người suy dinh dưỡng mau chóng hồi phục. Loại siêu thực phẩm này có thể là một
thành phần giá trị của bất kỳ của chương trình tăng cân hoặc giảm cân sức khỏe nào
Spiruỉina spp. cũng là nguồn cung cấp cacbonhydrate phức hợp tuyệt vời, nó chứa

glycogen dễ được cơ thể hấp thụ và biến đổi nhanh chóng thành năng lượng chúng ta
cần mỗi ngày [8], [17], [40].
y Hỗ trợ miễn nhiễm tự nhiên

Tảo (Spỉrulina spp.) chứa đựng nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự miễn
nhiễm tối ưu như GLA, beta-carotene và các carotenoid khác. Lượng giàu chứa GLA
gấp 3 lần so với dầu cây anh thảo. Nghiên cứu đã tìm ra GLA giúp làm giảm bệnh
huyết áp cao và giảm lượng cholesterol trong máu, làm dễ chịu các trường hợp viêm
khớp, các cơn đau tiền kinh nguyệt và các bệnh khác về da [ 8], [17]. Tảo (Spirulina
spp.) được nghiên cứu rộng rãi nhằm công bố đặc tính tăng cường miễn nhiễm, các
nghiên cứu cho thấy (Spiruỉina spp.) có thể làm tăng mức độ kháng thể và hoạt động đại
thực bào, cả hai đều quan trọng đối với một hệ thống miễn nhiễm mạnh mẽ, nó cũng
giúp cân bằng hoạt động hệ thống miễn nhiễm của bạn [8], [17], [41].
> Lọc và giải độc


1
4

Còn một lý do khiếp cho Spiruỉina spp. quan trọng chúng chứ diệp lục gấp nhiều
lần so với cỏ linh lăng hoặc lúa mì. Chất diệp lục là sắc tố giúp thực vật có màu xanh và
rất trong sạch, với nhiệm vụ là làm sạch hệ thống kim loại nặng và các độc tố khác
trong cơ thể có hại cho sức khỏe [40, 41, 42],
1.1.4.

cùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spỉrulina spp. từ năm 1968. Hiện nay
trong các đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng Spirulina spp.


1
5

Sản lượng Spirulina spp. trên thế giới khoảng 1000 tấn khô/năm. Những nước đi đầu
sản xuất đại trà loại tảo này là Mehico, Mỹ, Đài Loan, Ấn Độ. Trại tảo lớn nhất là ở
Hawaii có khoảng 25 ha và mới đây là Trung Quốc có khoảng 16 ha. Nhu cầu Spỉrulỉna
spp. trên the giới là rất lớn, tuy nhiên sản xuất chưa nhiều, nên giá bán những chế phẩm
Spirulina spp. rất đắt. Gần đây việc phát hiện và đưa vào sử dụng một số chất có hoạt

tính sinh học ở Spirulina spp. đã góp phần không nhỏ thúc đẩy quá trình nghiên cứu,
sản xuất cũng như ứng dụng có hiệu quả sinh khối tảo này [8], [17].
1.1.4.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước

Tảo (Spirulỉna spp.) được giáo sư Ripley D.Fox- nhà nghiên cứu về tảo và các
chế phẩm của tảo tại “Hiệp hội chống suy dinh dưỡng bằng các sản phẩm từ tảo” tại
Pháp đưa vào Việt Nam năm 1985. Trong những năm 1985 -1995 đã có những nghiên
cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấp nhà nước như nghiên cứu của GS.TS.
Nguyễn Hữu Thước và cộng sự -Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam với đề tài “Công nghiệp nuôi trồng và và sử lý tảo Spirulina Đồ
tài cấp thành phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hưng -TP Hồ Chí Minh và cộng sự với
đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thức ăn có tảo Spirulina trong dinh dưỡng điều
trị” [17], [32],
Cho đén nay, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và ché biến các sản phẩm từ tảo
Spirulỉna đã được thành lập. Đó là các cơ sở như Vĩnh Hảo - Bình Thuận, Châu Cát,

phủ nhận những tác dụng của thực phẩm chức năng mà thế giới đã thừa nhận. Do vậy
người tiêu dùng, nhất là người bệnh và những người có điều kiện về kinh tế nên tìm
hiểu và nên sử dụng ngày càng nhiều hơn các loại thực phẩm chức năng như là tảo
(Spiruỉina spp.) vì sức khoẻ của chính mình.
1.2.

Vi sinh vật và quá trình lên men tạo đồ uống có bồ sung tảo xoắn
(Spirulina spp.)

Hệ vi sinh vật lên men dịch tảo xoắn (Spirulina spp.) là một tập đoàn vi sinh vật
bao gồm các vi khuẩn và nấm men.
1.2.1.

Vi khuẩn lactic

Phân loại khoa học
Giới

Vi khuẩn

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Loài


Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong môi trường khô, có thể chịu được hàm lượng
cồn từ 10 - 15% và có thể chịu được nồng độ C0 2 cao. Chúng được tìm thấy khắp nơi
trong tự nhiên, dưới da, trong hệ tiêu hoá... Lactobacillus có vai trò quan trọng nhất
trong lên men lactic, là vi khuẩn kị khí Gram dương, có dạng hình que dài, không sinh
bào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động. Chúng là nhóm chính
của vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng biến đổi đường lactozo và những
đường khác thành axit lactic. Chúng là vi khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính. Ở
người, chúng có mặt ở âm đạo và ở ruột. Nhiều loài có ở thực vật đang phân rã. Sự sản
xuất axit lactic làm ngăn cản sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có hại khác [2],
[10], [38].
Cơ chế của quá trình lên men lactic
Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kị khí làm biến đổi các
hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác. Các sản phẩm
như acid lactic, ethanol, C02 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men còn các phân
tử ATP được giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng


1
8

của vi sinh vật. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men
ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác [1].
Có hai kiểu lên men lactic:
Lên men lactic đồng hình hầu như chỉ cho ra sản phẩm là acid lactic.
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic còn
có các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, C02...
Ngoài ra, trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới là sản
phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Một số hợp chất dễ bay hơi
có vai trò quan trọng góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho các sản phẩm lên
men lactic. Lượng sản phẩm phụ thu được hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,

1
9

được vitamin Bi, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công
nghiệp sản xuất vitamin C), hay như Acetobacter xylinum có thể tổng họp được sợi
cellulose giống như những sợi bông [29].
1.2.3.

Nấm men

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ, hình quả
chanh... kích thước tương đối lớn: đường kính khoảng 7ịim, chiều dài: 8-12|im. Hình
dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn
đơn bào, tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào,
màng nguyên sinh chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ
Có rất nhiều cách phân loại, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men thật
(Ascomyces) và nấm men giả (Fungiim porfecti).
+ Lớp nấm men thật ( Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp
thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống Schizosaccharomyces
giống Endomyces.
+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crytococus (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida', Rhodotorula.

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, té bào nấm men tăng
nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho đến khi cơ chất của
môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh trưởng phát triển của chúng chậm
và ngừng hẳn. Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng
sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh
dưỡng và tế bào không còn khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản

phẩm lên men khác với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol
cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá trình này nhiều acid hữu
cơ được tạo thành, một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs. Nếu quá
trình lên men trong điều kiện kị khí không nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm
lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [4], [16].
1.2.4.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo đồ uống có bỗ

sung tão xoắn (Spirulina spp.)
1.2.4.1.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic [23]

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng
không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon,
nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như
vitamin, muối vô cơ...


2
1

> Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit
(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng
lượng, xây dựng cấu trúc té bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid
hữu cơ.
> Nhu cầu dinh dưỡng nỉtơ

> Nhu cầu dinh dưỡng oxỉ
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa
sống được trong môi trường không có oxy. Trong điều kiện kị khí sinh khối vi khuẩn sẽ
phát triển nhanh hơn so với điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tử
glucozo sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành C02 và H20 và tổng hợp các enzyme, từ một phân
tử glucozo tạo ra 36 hoặc 38 ATP.
y Các quá trình sinh lí

Te bào vi khuẩn có thể sống độc lập. Quá trình sống của chúng gồm các quá
trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng và đặc điểm di truyền.
> Dinh dưỡng
Dinh dưỡng cacbon: các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn
xuất, rượu, acid hữu cơ, acid amin... có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của vi khuẩn
lactic, trong đó nguồn đường là chủ yếu. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều nguồn
đường khác nhau như sucrozo, maltozo, lactozo, glucozo...
Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ có khả
năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn
nitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê, nucleotit... Đạm vô cơ là các
muối amon khử nitrat, Sulfat, acetat...
Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin là nhân tố
sinh trưởng cơ bản của nấm men.
1.2.4.2.

Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua
việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm
hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
> Lên men lactic đồng hình [1], [4], [5]
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactic


+

H3PO4+PN+

H2O

Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự
có mặt của lactaxenase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D(-), L(+) hoặc DL.


y Lên men lactỉc dị hình [1 ], [4], [5]

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid
lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid
succinic, C02,...
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H 0 ^CH CH0HC00H + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C HSOH +CO2. ..
12

6

3

2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu
etylic và acid acetic 10% các lọai khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó
là sự tích luỹ một lượng ít acid íbocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng
kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức