VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO
VỆ MÔI TRƯỜNG

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT TÁI TỔ
HỢP GEN ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1. Công nghệ sinh học cổ điển (hay CNSH đại phân tử) và công nghệ sinh học
hiện đại (hay CNSH phân tử)
CNSH đại phân tử là lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh vật và vi sinh
vật (VSV) ở mức độ nguyên trạng, tức là chưa đi sâu vào tìm hiểu và ứng dụng
ở mức độ cấu trúc phân tử mà chỉ tận dụng những đặc tính kiểu gen (genotype)
và kiểu hình (phenotype) của chúng để sử dụng và chọn lọc loại tối ưu cho mục
đích đặt ra.
CNSH phân tử (Molecular Biotechnology) là một lĩnh vực tổng hợp có
liên quan rất lớn đến các ngành di truyền phân tử, tế bào học, VSV học, sinh
hoá học....
CNSH phân tử có hai lĩnh vực chính là CNSH phân tử cơ bản và CNSH
phân tử ứng dụng.
• CNSH phân tử cơ bản: bao gồm các thao tác DNA ở mức độ phân tử như
cắt, nối, ghép, chuyển nạp, dẫn truyền các loại gen ngoại lai hữu ích vào
các dòng tế bào chủ thích hợp để duy trì gen đó.
• CNSH phân tử ứng dụng: chọn lọc, nhân lên, sản xuất...những dòng tế bào
đã được tái tổ hợp để thu được những sản phẩm có ích cho con người.
CNSH phân tử cơ bản và CNSH ứng dụng là hai bước kế tiếp nhau để đưa
nguyên lý tái tổ hợp gen thành hiện thực, sản xuất các thành phẩm hữu ích theo
công nghệ mới- Công nghệ sinh học.
1.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp gen ứng dụng trong CNSH
1.2.1. Mở đầu và khái niệm:
Năm 1970, lần đầu tiên, Baltimore và Temin độc lập phát hiện loại
enzyme có tác dụng sao chép ngược (reverse transcriptase) có tác dụng tham gia
hoạt hoá cho quá trình tổng hợp ngược DNA từ khuôn RNA (reverse
transcription). Điều này cho phép một khi đã có một RNA thông tin (mRNA)

Như vậy, bằng enzyme hạn chế, ta có thể cắt một chuỗi DNA nào đó
thành nhiều đoạn, rồi ghép một đoạn nào đó vào plasmid cũng đã bị cắt bằng
một enzyme tương tự để tạo nên một plasmid mới mang đoạn DNA ngoại lai.
Nếu đoạn DNA đó là một gen hoàn chỉnh chúng ta có một plasmid mới mang
gen ngoại lai. Kỹ thuật cắt-nối-ghép và tạo nên một thực thể vi sinh mới, mang
một hay nhiều đoạn DNA ngoại lai, được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA
(recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngoại lai đó được gọi là
plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid). Khi pla smid đó được đưa vào tế bào
vi sinh vật chủ, quá trình đó được gọi là quá trình chuyển nạp (transformation).
Plasmid mang DNA ngoại lai đóng vai trò chuyển DNA vào trong tế bào chủ
được gọi là vector dẫn truyền (cloning vector).
Vector dẫn truyền có thể là plasmid hay bất kỳ một loại thực thể vi sinh
khác, như virus chẳng hạn. Khi một vi sinh vật chủ (nấm men hay vi khuẩn...)
đã tiếp nhận vector dẫn truyền để thực hiện những quá trình sinh học tiếp theo
với DNA ngoại lai đã được chuyển nạp, thì dòng VSV đó được gọi là VSV tái
tổ hợp (recombinant microorganism).
Khi nuôi cấy VSV tái tổ hợp, nếu DNA ngoại lai là một gen hoàn chỉnh,
được bố trí trong điều kiện có cấu trúc vector dẫn truyền thích hợp, thì gen đó
có thể tổng hợp được protein ở trong tế bào vật chủ. Vector dẫn truyền có cấu
trúc đặc biệt này được gọi là vector biểu thị gen (expression vector).
1.2.2. Các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen
Kỹ thuật tái tổ hợp gen bao gồm nhiều công đoạn khác nhau,có thể được tóm
tắt như sau:
• Cắt DNA bằng enzyme hạn chế (RE)
• Phân lập đoạn DNA đã được cắt
• Cắt plasmid tương ứng bằng enzyme hạn chế thích hợp
• Nối ghép đoạn DNA ngoại lai vào plasmid
• Chuyển nạp vào tế bào VSV chủ thích ứng
• Chọn lọc dòng đã được tái tổ hợp theo nguyên tắc kháng kháng sinh
• Nhân dòng đã chọn lọc

tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform.
Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại.
§ Bước 3: Tủa các nucleic acid. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận
nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân
huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng trở lại trong dung
dịch theo nồng độ mong muốn. Phương pháp thông dụng là tủa trong
isopropanol với tỉ lệ thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA
có TLPT thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa
trong isopropanol. Sau đó, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm.
Tiếp theo, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu
vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ -20
o
C.
- Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme
ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm
các bước cơ bản như đối với DNA:
Tế bào, mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy
mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính
protein biến tính mạnh (guanidinium thiocyanate), một chất khử (2-
mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động
của các Rnase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử
RNA.
Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol:chloroform
và li tâm.
RNA hoà tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol và được
thu nhận lại qua li tâm. RNA có thể được bảo quản trên một năm
dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70
o
C trong

với nồng độ 1.5-2.0 mM trong
phản ứng PCR.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 bước:
Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm tất cả các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là 94-95
o
C trong vòng 30 giây đến 1-2 phút.
Chuỗi DNA bị bung mối liên kết hydro và tạo nên hai sợi DNA làm
khuôn. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 37-65
o
C (thấp hơn Tm
của các primer), thông thường là 45-55
o
C (mà cho phép các primer bắt
cặp với các sợi DNA làm khuôn ở những vị trí thích hợp của chúng ),
trong khoảng từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization)
hay gắn (annealing)
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72
o
C giúp cho DNA polymerase
hoạt hoá các primer để chúng trượt trên các sợi khuôn, lấy các dNTP
trong môi trường bổ sung vào sợi mới và tạo nên DNA mới. Thời gian
của bước này tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kép dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay
kéo dài (elongation)
Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, thường sau 25-
35 chu kỳ là tốt nhất.

acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ
các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid
cần phân tách.
Bảng 1. Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách
% acrylamide

4
5
8
11
Kích thước các đoạn cần phân tách
(cặp nucleotide)
200-800
80-200
40-100
10-50
% agarose

0.6-0.8
0.9-1.2
1.2-1.5
Kích thước các đoạn cần phân tách
(kb)
1-20
0.5-7
0.2-5
§ Gel agarose:
Là loại gel thông dụng nhất bởi thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách
những đoạn có kích thước 0.5-20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang
và điện di được thực hiện thep phương nằm ngang. Sau điện di, các nucleic acid

theo một trong các phương pháp sau:
Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA
được thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch
đệm thích hợp.
Phương pháp 2: Một giếng nhỏ được khoét trong agarose ngay trước
vạch DNA. Giếng này được bơm dầy dung dịch đệm và điện trường được
tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm và được thu
nhận lại.
Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc
biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65
o
C). Sau điện di, vạch DNA được cắt
ra, ủ ở trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 65
o
C. Khi agarose đã hoàn
toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và
tủa.
b) Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền
Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi
nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số luợng phage tăng lên đến hàng
triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tượng
này có thể là do DNA của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt
khi vừa mới xâm nhập. Hệ thống bảo vệ này là các RE. DNA vi khuẩn không
bị chính các RE của chúng cắt là nhờ cơ chế gắn nhóm methyl vào A hay C ở
các vị trí cắt của các RE bởi enzyme methylase . Khi đó RE không còn nhận
biết được các vị trí cắt. Đây chính là hiện tượng giới hạn và các RE hợp thành
hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote.
Các RE là các endonuclease có khả năng nhận biết và cắt DNA mạch đôi