Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN
theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu
nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và
dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh
hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn
kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài
chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi
khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của
phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi
khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn
trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được
thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn.
Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức
là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy
là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được
đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được
thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong
nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm
PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định
typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym
ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94
o
C và như
vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình
này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus
) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc

Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR.

Thành phần Số lượng
ADN khuôn 10-100 ng
dNTP (mỗi loại) 200 mM
Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM
Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM
Taq polymerase 1 U
KCL 50 mM
Tris HCL (pH 8.4) tại 25
o
C 10 mM
MgCl
2
2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều
chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau,
có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của
các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo
thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc
chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,
điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid
amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện
phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành
phần như nhiệt độ, nồng độ Mg
++

trong gene. Như vậy phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm
trong sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm
tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng PCR.
Phản ứng PCR phiên mã ngược được dùng để nhân ADN từ ARN của
virus. Việc kết hợp phản ứng này với PCR lồng có tác dụng phát hiện ARN tại
thời điểm nhất định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều được ứng dụng trong phương pháp giải trình tự
ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR.phẩm PCR.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho xác định typ vi sinh vật:
Như đã trình bày ở trên, dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định được
gene đặc trưng cho loài hay thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Các chiến
lược ứng dụng lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật
trong nghiên cứu dịch tễ học được chia làm 4 nhóm sau:
- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc
hiệu.
Trong trường hợp này dùng kết hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR với enzym cắt
hạn chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid Một
dẫn chứng cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene synthase citrat trong Ricketsiae sau đó sản
phẩm PCR được xử lý với enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các chủng với nhau (Regnery và
Ctv, 1991). Các ví dụ sau (bảng 1.8) đã cho thấy hiệu quả của phương pháp này.
Bảng 1.9. Một số ví dụ cho kỹ thuật RFLPs (Restriction Fragment Length
Polymorphism) phân tích các gene đặc hiệu được nhân lên bằng kỹ thuật PCR.
Chủng vi sinh vật nghiên cứu Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn
Chlamydia spp. Kaltenboek et al (1992)
Clostridium spp. Gurtler et al. (1991)
Helicobacter pylori Foxall et al. (1992)
Hepatilis C virus Okamoto et al.(1992)
Mycobacterium tuberculosis Ross &Dwyer(1993)
Nitrobacter spp. Navarro et al.(1992)
Rickettsia spp. Regnery et al. (1991)

pháp ứng dụng. Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể sử dụng
mẫu dò là đoạn nucleotid bổ sung với đoạn 16S của rARN như là một trong số
mồi cho phép nhân phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện nhờ
kỹ thuật PCR nhân sản phẩm cDNA được dùng cho phát hiện Helicobacter spp.
Độ nhạy của phương pháp phát hiện này tăng 50 lần so với phương pháp
truyền thống.
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phương pháp trực tiếp cho kết quả finger printing không cần sử
dụng enzym cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gene
lặp lại. Thuật ngữ rep-PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu
để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ.
Các chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao trong các đối tượng thuộc
Enterobacteriaceae và một số đối tượng khác (Versalovic và Lupsky, 1991).
Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể lai với cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có
kích thước 126bp (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus-ERIC) và
đoạn 38bp (repetitive extrageneic palindromic-REP) từ bộ gene của
Enterobacteriaceae vi khuẩn gram âm và một số chủng có quan hệ xa khác. Có
thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene bảo thủ để thu được kết quả
finger printing sau khi nhân gene dùng bộ gene của các vi sinh vật có mang
các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện được trên agarose
các đoạn gene có kích thước khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau. Kỹ
thuật này được ứng dụng đã đem lại kết quả tốt khi nghiên cứu mối quan hệ
trên các đối tượng Bacillus subtilis (Versalovic và cộng sự, 1992), Citrobacter
diversus (Woods và cộng sự, 1991), Rhizobium meliloti (Brujin, 1992). Thực tế
phương pháp tạo ra kết quả finger printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của
Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991) và được ứng dụng trên tất
các vi khuẩn có mang các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên.
Phương pháp tương tự cũng cho phép phát hiện sự khác nhau từ các
nguồn ADN trên các đối tượng nhân thực thuộc chi Naegleria như mô tả của
Belkim và Quint (1992). Phương pháp này dùng cho phát hiện đa hình các

Listeria monocytogenees Czajka & ctv (1993)
Porphyromonas gingivalis Menard &ctv (1992)
Rhizobium spp. Harrison &ctv (1992)
Staphylococcos spp. Weish &McClellADN (1990)
Streptococcus spp. Weish &McClellADN (1990)
Streptococcus uberis Jayarao &ctv (1992) Hình 1.9. Minh hoạ kết quả phân tích sử dụng kỹ thuật RADP.
b. Giải trình tự ADN
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và
định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy
định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh
chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành
phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống
học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ
được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong
khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa
cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau.
+ Nguyên tắc:
Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN
được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra
trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai
khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và
phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1
nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam &
Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger,
1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.
+ Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của
Sanger:

Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau:
1. Chuẩn bị ADN khuôn.
2. Điều kiện bắt cặp mồi.
3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN.
4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel.
5. Đọc kết quả.
Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như
sau:
1, Chuẩn bị ADN khuôn:
Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn
(vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả
là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường
đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản
ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế
của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện
nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng
trở lên phổ biến.
2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi
khuôn:
Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự
ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó
sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được
lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi
khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn
của gene (300 – 500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước
lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng
cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ
để đọc cho hết trình tự của gene.
Phương pháp tiếp theo là sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ

được dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày
nay nhiều người đã chuyển sang dùng S
35
thay thế cho P
32
, kết quả là cho độ
phân giải cao hơn.
Mới đây phương pháp giải trình tự dựa trên kỹ thuật PCR được gọi là chu
kỳ giải trình tự trực tiếp ADN đang thay thế phương pháp cũ dùng enzym
sequenase. Về nguyên tắc thì các phương pháp này là giống nhau. Ưu thế của
phương pháp này là: lượng ADN đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có mức độ
tinh sạch cao. Ngoài ra, có một ưu điểm nữa là phản ứng xảy ra ở nhiệt độ
cao, do đó đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp khác khi
giải trình tự đối với các sợi khuôn có cấu trúc bậc 2 (Fan & cộng sự, tạp chí
Biotechniques 21: 1132-1137).
4, Tách sản phẩm trên gel urea-acrylamid:
Cho đến nay đã có nhiều tiến bộ trong kỹ thuật điện di gel kể từ năm
1970 khi mà người ta phát hiện ra phương pháp này. Tiến bộ quan trọng nhất
là gel gradient tạo ra độ dãn cách thích hợp để đọc được thêm từ 50-100 base.
Đầu tiên, gradient được tạo ra giữa acrylamid và gradient muối khi đổ gel. Có
thể có cách khác nữa là người ta thay đổi độ dày của gel bằng spacer. Phương
pháp dễ nhất là bổ sung nồng độ muối NaOAc vào bể đệm dưới khi chạy gel,
kết quả sẽ tạo ra một gradient cần thiết mà không mấy khó khăn.
Có nhiều cách cải tiến khác nhau để tạo ra gel có độ phân giải cao, ví dụ
tạo ra gradient đối với acrylamid mạch thẳng hay bổ sung một số chất tạo ra
gradient (Long Ranger). Mặt khác việc đổ gel cũng được đơn giản hóa bước sử
dụng băng dán. Một số người dùng các gel siêu mỏng để đạt độ phân giải cao.
Nhiều thiết bị được phát minh nhằm thu nhận các băng đã được tách riêng khi
chúng ra khỏi gel, và gần đây những thiết bị này đã được thương mại hóa.
Nhuộm bạc là phương pháp tương đối hiệu quả để xác định các trình tự