Chương 3
Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm
I. Khái quát về chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm là việc xác định nguyên nhân (và tên gọi) của hiện
tượng bệnh lý đang có thông qua các thủ tục mô tả những hiện tượng bệnh lý đang gặp ở
cá thể (bệnh) và ở quần thể (dịch) hoặc/và mô tả mầm bệnh đã được phân lập để so sánh
những thuộc tính thu được đó với những thuộc tính của các bệnh/dịch hoặc mầm bệnh đã
được mô tả, phân loại và định danh (đặt tên) và quy thuộc hiện tượng bệnh lý đang có vào
một nhóm hiện tượng bệnh lý đã được phân loại và đặt tên. Mô tả có thể dựa vào triệu
chứng lâm sàng (chẩn đoán lâm sàng), bệnh tích (chẩn đoán giải phẫu bệnh lý), đặc điểm
dịch học (chẩn đoán dịch tễ học) và các đặc điểm vi sinh vật học, huyết học, huyết thanh
học, sinh học phân tử (chẩn đoán xét nghiệm). Như vậy, ta gọi được tên bệnh đang có là
nhờ vào việc xác định tính tương đồng của các biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh với các
biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh của những bệnh đã đặt tên từ trước. Thủ tục chẩn đoán
(giống như thủ tục nhận dạng) vì vậy được gọi là thủ tục đồng định (identification). Trên
thực tế, quá trình quy thuộc được thực hiện qua hàng loạt bước loại suy, ví dụ "vi khuẩn
phân lập được nhuộm màu Gram âm vậy không thể là Bacillus hay một vi khuẩn Gram
dương nào khác". Do đó, chẩn đoán còn là quá trình giám biệt (differentiation), còn các
tính trạng quan trọng giúp chẩn đoán được gọi là những đặc điểm giám biệt. Tuy nhiên,
nhiều khi thủ tục chẩn đoán chỉ là việc xác nhận sự hiện diện của một mầm bệnh (chẩn
đoán bệnh nguyên học xác nhận kết quả chẩn đoán khác).
Đồng định, như vậy, không chỉ là "xác định", mà là xác định có định hướng trên
cơ sở những kiến thức đã biết trước của nhà chuyên môn về các loại bệnh và/hoặc mầm
bệnh. Hơn nữa đồng định có thể thất bại. Sau mọi nỗ lực đồng định, nếu đồng định vẫn
thất bại, nhà chuyên môn có thể đưa ra giả thuyết về loại bệnh mới, chưa được biết.
Trong điều tra dịch tễ học người ta nghiên cứu tốc độ truyền lây, tỷ lệ mắc bệnh
mới, tỷ lệ lưu hành bệnh, tỷ lệ tử vong, tuổi và giống phát bệnh chủ yếu, vùng phát sinh,
yếu tố thời tiết, sinh sản dị thường hoặc đẻ trứng dị thường, giảm sản lượng sữa hoặc tỷ
lệ đẻ trứng, thay đổi thức ăn, nhập động vật mới, sự truyền lây bệnh sang loại động vật
khác, lịch sử tiêm phòng vacxin,... Đặc biệt, điều tra dịch học là hết sức quan trọng trong
quá trình nhận biết bệnh truyền nhiễm phát sinh ở động vật được chăn nuôi tập trung

là tốt. Tuy nhiên, trong những bệnh cảm nhiễm mãn tính bệnh nguyên vẫn còn có thể
phân lập được ngay cả khi bệnh đã qua. Vị trí lấy bệnh phẩm thích hợp trong đa số
trường hợp là tổ chức có biến đổi bệnh lý (ổ bệnh) hoặc vị trí liên quan. Ví dụ, trong bệnh
cơ quan hô hấp lấy dịch xoang mũi và khí quản, trong bệnh thần kinh lấy máu hoặc tủy
sống, trong bệnh đường tiêu hóa lấy phân hoặc dịch từ hầu họng, trong bệnh ở da thì lấy
nội dịch bọc nước và bọc mủ, trong bệnh đường sinh dục tiết niệu thì lấy nước tiểu hoặc
dịch thẩm xuất tử cung,... Hơn nữa, trong trường hợp phân lập mầm bệnh từ mẫu bệnh
phẩm mổ khám bệnh tích thì cần lấy một cách vô trùng tránh vi khuẩn đường ruột ô
nhiễm các loại bệnh phẩm (não, gan, lách, hạch lympho,...), thời điểm lấy các mẫu sau
chết càng sớm càng tốt vì sau khi súc vật chết vài giờ các nội quan và máu đã bị tạp
khuẩn xâm nhập và phát triển. Hơn nữa, đối với các bệnh cảm nhiễm virut có chứng
nhiễm virut huyết nặng như bệnh sốt lưu hành bò thì cần lấy máu vào thời điểm sốt. Sau
phát bệnh hai tuần trở đi là thời kỳ lấy máu thu huyết thanh kỳ hồi phục. Trong thời kỳ
này hiệu giá kháng thể tăng so với thời kỳ sốt cấp tính chứng tỏ mầm bệnh chứa kháng
nguyên thuộc loại dùng để phát hiện kháng thể. Ví dụ, nếu một bệnh xuất hiện trong quần
thể thì ở các cá thể bị bệnh cấp tính triệu chứng bệnh kéo dài khoảng 1 tuần, khi đó khả
năng phát hiện được mầm bệnh nhờ lấy mẫu để phân lập trong khoảng 1 tuần đó cho đến
vài ngày sau đó. Trong kỳ cấp tính này kháng thể đặc hiệu chưa được hình thành. Tuy
nhiên, sau thời điểm này kháng thể đặc hiệu bắt đầu tăng dần. Nếu lấy mẫu huyết thanh
kỳ hồi phục (từ 10 ngày cho đến 1 tháng sau khi xuất hiện triệu chứng thì hàm lượng
(hiệu giá) kháng thể cao hơn nhiều so với lần lấy máu kỳ cấp tính. Trong kỳ hồi phục
này, ngược lại khó có thể phân lập được mầm bệnh.
Trong kiểm tra bệnh nguyên, sau khi lấy mẫu nên xét nghiệm mẫu càng sớm càng
tốt. Trong trường hợp không thể thực hiện xét nghiệm ngay được, nếu để phân lập vi
khuẩn thì bảo quản bệnh phẩm ở 4 °C hoặc đôi khi đông lạnh. Nhưng với bệnh phẩm để
kiểm tra virut thì cần bảo quản ở -70 °C hoặc bảo quản trong dung dịch PBS (dung dịch
sinh lý đệm phosphat) pha 50% glycerin.
2. Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên
Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên bao gồm một số phương pháp bên cạnh việc chẩn
đoán lâm sàng: kiểm tra trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đồng định mầm bệnh qua các xét

kiểm tra sau
khi làm sạch
và tăng nồng
độ các bệnh
phẩm (dịch ổ
viêm, niêm
dịch mũi,
phân,...)
hoặc các tiêu
bản lá siêu
mỏng làm từ
tổ chức bệnh
biến đã
nhuộm âm
bản. Các
phương pháp
kháng thể
huỳnh quang
và nhuộm tổ
chức sử dụng các tiêu bản làn mỏng tế bào tách biệt hoặc từ lát cắt tổ chức.

Các phương pháp kiểm tra trực tiếp rất hữu ích trong các trường hợp phải chẩn
đoán nhanh một cách chính xác để có đối sách dự phòng sớm đối với các virut khó hoặc
không thể nuôi cấy.
2.1. Phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình
Các phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình bao gồm hiển vi trực tiếp tiêu bản
nhuộm (nhuộm Gram, Giemsa,...) hoặc tiêu bản tươi, hoặc sau khi nuôi cấy khởi đầu
phân lập vi sinh vật gây bệnh thì nghiên cứu các đặc điểm sinh lý (khả năng phát triển
trong các môi trường và đặc điểm lứa cấy,...), đặc điểm sinh hóa (phân giải hay tổng hợp
các chất, sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa,...), khả năng đề kháng (hay mẫn

hiện kháng nguyên (nếu có sẵn kháng thể đặc hiệu) hoặc phát hiện kháng thể (nếu có sẵn
kháng nguyên).
Việc phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm thường có thể khẳng định sự hiện
diện của mầm bệnh. Tuy nhiên, phản ứng này thường khó khăn hơn so với các phản ứng
phát hiện kháng thể. Phát hiện ra kháng thể cho phép kết luận rằng trong quá khứ động
vật đã bị kháng nguyên xâm nhập (có thể là bị cảm nhiễm hoặc đã được tiêm vacxin).
Như vậy, phát hiện kháng thể trong máu động vật có thể không có ý nghĩa chẩn đoán.
Tuy vậy, nếu thực hiện hai lần xét nghiệm kháng thể (cách nhau một số ngày) trong quá
trình bệnh lâm sàng mà thấy có sự tăng cao hàm lượng (hiệu giá) kháng thể chứng tỏ
bệnh do mầm bệnh (mang kháng nguyên) tương ứng gây ra.
3. Phân lập và đồng định bệnh nguyên
Đồng định mầm bệnh nhằm trả lời câu hỏi có phải bệnh (với những triệu chứng
lâm sàng và đặc điểm bệnh tích đã mô tả) gây ra bởi vi sinh vật nào đó (thuộc loại đã
được biết là gây bệnh) hay không. Hay nói cách khác, đồng định mầm bệnh là xác định
mầm bệnh nghi ngờ có mặt trong bệnh phẩm có thực sự có mặt trong đó hay không. Việc
nghiên cứu là khá đơn giản nếu chỉ có một tác nhân gây bệnh nghi ngờ. Khi đó chỉ cần
trả lời kết quả dương tính hay âm tính. Tuy nhiên, nhiều khi số chủng loại mầm bệnh
thuộc đối tượng nghi ngờ không ít. Khi đó, rất có thể phải áp dụng đồng thời nhiều hướng
nghiên cứu phân lập và các kỹ thuật kiểm định khác nhau (vi sinh vật học, huyết thanh
học, phân tích phát hiện gen đặc hiệu mầm bệnh,...).
3.1. Vi khuẩn
Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh phải dựa trên những hiểu biết trước về
đặc tính của loại mầm bệnh đó bởi vì chỉ có như vậy mới có thể nuôi cấy khởi đầu thành
công cũng như phân lập được vi khuẩn mầm bệnh dưới dạng lứa cấy thuần khiết để có
nguyên liệu cho các xét nghiệm sau đó. Nhiều vi khuẩn phát triển mạnh, có thể hình
thành khuẩn lạc (từ một tế bào ban đầu) sau một ngày đêm (ví dụ, E. coli) nhưng nhiều vi
khuẩn khác lại cần nuôi cấy trong thời gian kéo dài (2 tuần đến 2 tháng đối với trực
khuẩn lao,...) và cũng có vi khuẩn không nuôi cấy được trên môi trường dinh dưỡng nhân
tạo (vi khuẩn bệnh Tyzzer, bệnh phong). Những vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện là
khá thuận lợi cho việc nuôi cấy phân lập nhưng các vi khuẩn yếm khí thường đòi hỏi

tế bào, cấu trúc kháng nguyên,...
3.2. Virut
Việc nuôi cấy phân lập virut đòi hỏi phải có môi trường tế bào sống như động vật
thí nghiệm, lứa cấy tế bào tổ chức, trứng gà đang phát dục (phôi gà) với một số xử lý đối
với bệnh phẩm. Bệnh phẩm được nghiền nhỏ, pha với nước sinh lý cho có đủ độ loãng
nhất định, thêm chất kháng sinh (thường là penicillin và streptomycin) để diệt vi khuẩn.
Để loại bỏ vi khuẩn, có thể lọc bệnh phẩm đã nghiền (thường với cát vô trùng để tăng khả
năng giải phóng virion) qua lọc vi khuẩn (đường kính lỗ khổng <0,22 μm) rồi cấy vào
môi trường lứa cấy tế bào một lớp, phôi gà hoặc động vật thí nghiệm. Với động vật thí
nghiệm cần theo dõi thường xuyên các triệu chứng lâm sàng, sau đó mổ kiểm tra bệnh
tích, dựa trên các triệu chứng và bệnh tích điển hình mà khẳng định sự phát triển của
virut. Nếu không có biểu hiện lâm sàng và bệnh tích, cần thực hiện phản ứng huyết thanh
học để phát hiện và trắc định kháng thể, so sánh hai kết quả hàm lượng (hiệu giá) kháng
thể trước và sau quá trình theo dõi vật sau tiêm truyền có thể khẳng định về sự phát triển
của virut trong cơ thể động vật.
Ở lứa cấy tế bào, nhiều loại virut gây hiệu quả bệnh lý tế bào (CPE) hay bệnh tích
tế bào. Dựa vào CPE đặc trưng ta có thể xác nhận được sự phát triển của virut phát triển
trong lứa cấy tế bào tổ chức. Nếu không biểu hiện CPE có thể kiểm tra sự hiện diện của
kháng nguyên bằng phản ứng huyết thanh học.
III. Chẩn đoán huyết thanh - miễn dịch học
1. Phương pháp huyết thanh học
Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên
cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần
đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể
hoặc kháng nguyên). Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm
nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng. Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng
nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động
vật còn sống. Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể. Phản ứng
này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng. Kết quả dương tính thường nói
rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể

giữa hai lớp dịch một chút). Kỹ thuật này thường dùng phát hiện kháng nguyên giáp mô
vi khuẩn nhiệt thán (phản ứng Ascoli).
Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch có một số biến thể: khuyếch tán một
chiều, khuyếch tán hai chiều. Kỹ thuật khuyếch tán một chiều ít được sử dụng do phải
tiêu tốn lượng lớn yếu tố phản ứng (kháng huyết thanh hoặc kháng nguyên). Người ta pha
thạch (agar hoặc agarose) vào dung dịch sinh lý NaCl 0,8 - 0,85% (pH 7,2) ở nồng độ
thạch khoảng 1% (0,8 - 2,0% agar, phụ thuộc vào chất lượng thạch, có thể kiểm tra bằng
thực nghiệm), đun tan chảy đều rồi ủ duy trì ở 50 °C. Ở nhiệt độ này thạch ở trạng thái
lỏng, có thể cho vào đó một lượng kháng nguyên (hoặc kháng thể), trộn đều rồi đổ thành
bản thạch trên phiến kính (hoặc trong đĩa Petri), đục lỗ, mỗi lỗ cho một loại mẫu cần xét
nghiệm. Nhỏ vào đó một lượng kháng thể (hoặc kháng nguyên). Ủ vào buồng ẩm ở nhiệt
độ phòng hoặc 4 °C. Sau một thời gian nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy vòng kết tủa
trắng xuất hiện quanh lỗ tương ứng.
Phản ứng kết tủa khuyếch tán hai chiều được thực hiện một cách đơn giản nhất
với hai lỗ nhỏ được đục trong khối thạch agarose, một lỗ chứa kháng nguyên còn lỗ kia
chứa kháng thể. Ủ trong buồng giữ ẩm một số ngày và theo dõi hàng ngày, nếu phản ứng
xảy ra ta sẽ thấy đường kết tủa trắng xuất hiện giữa hai lỗ (ở vùng có tỷ lệ hóa trị kháng
thể và hóa trị kháng nguyên xấp xỉ 1). Tuy nhiên, phản ứng này thường có độ nhạy rất
thấp do đó cần vận dụng phương pháp cải tiến như dưới đây.