Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử
Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27/02/2007
Những bài cùng tác giả
1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật
truyền thống:
Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các
đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào
khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid
trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v..Các đặc trưng này đôi
khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi
sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với
nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria). Hạn chế của
các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải
xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn
vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có
mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái.
Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:
Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến
nhiều nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho
các vi sinh vật riêng biệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho
phân loại các vi sinh vật.
- API20E KIT,
nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có
nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng
còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong
các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong
plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế
bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn
đến sai khác và làm sai kết quả.
Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn
để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại
bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi
vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu
bacteriocin.
Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống được sử dụng trong
nhiều nghiên cứu phân loại nhưng không có phương pháp nào tỏ ra
vạn năng thích hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ
có thể đạt được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.
2. Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân
tử:
Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả
năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi
sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một
số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp
dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật.
Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ
thuật chủ yếu là:
+ Phân tích acid nucleic.
+ Phân tích protein.
+ Phân tích lipopolysaccharid.
+ Hóa phân loại học.
Trong phần này chúng tôi tập trung giới thiệu một số kỹ thuật
phân loại liên quan đến acid nucleic. Các phần sau chúng tôi lần lượt
giới thiệu các phương pháp liên quan đến polysaccharid, lipoprotein và
hóa phân loại.
2.1. Phân tích acid nucleic:
Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích
kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid
nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với RNase (ribonuclease
A). Tuy nhiên, có thể tách theo các phương pháp như:
- Tách bằng Caeseium chloride.
- Tách bằng KIT QIAGENE.
- Tách bằng kỹ thuật khác.
+ Điện di plasmid trên gel agarose:
Sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trước khi
phân tích kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích
thước của chúng. Khi tiến hành điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1%
với một trong các đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH
8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và
TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau khi điện di, gel
được nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dưới tia UV (310 nm).
Nồng độ ethidium bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm là 10
phút. Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion trước khi được
nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài liệu.
Một số vấn đề cần lưu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông
thường plasmid được thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và
dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ
cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1).
Hình 1.1. Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi
điện di
Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những
trường hợp plasmid có kích thước nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm
sắc thể. Trong mọi trường hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di động
nhanh nhất trừ các trường hợp plasmid như vậy không được nhầm lẫn
giữa plasmid siêu xoắn và dạng chính plasmid đứt gãy và plasmid khác.
Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh kích thước giữa các
1.2 0.2-8
1.5 0.2-6
2.0 0.1-5
Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991) phổ các băng
ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên dưới 10 băng và nên có cả băng
kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên, các băng lớn không nên
vượt quá 10 do băng có kích thước lớn như vậy khó di chuyển trên gel.
Trong các trường hợp so sánh thì nên dùng thang chuẩn ADN để so
sánh kích thước và phép phân tích dấu vân tay cho các lần phân tích
khác nhau. Như đã trình bày ở trên, nếu như phân tích các chủng vi sinh
vật dựa vào kích thước plasmid có ý nghĩa đối với các đối tượng có
nhiều plasmid thì phương pháp xử lý enzym cắt hạn chế lại có ý nghĩa
lớn trong các trường hợp nghiên cứu dịch tễ học trên các chủng có cùng
phổ plasmid hay plasmid có kích thước giống nhau. Người ta đã ứng
dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh
từ thực phẩm (Hamburger). Các plasmid từ các chủng khác nhau thì có
phổ khác nhau về các đặc điểm cắt bởi enzym cắt hạn chế. Kết quả tạo
ra các mảnh ADN đặc trưng cho cá thể làm cơ sở cho phép so sánh. Tuy
nhiên khó có thể so sánh kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm
khác nhau, sở dĩ như vậy là do không dùng cùng một loại enzym cắt
hạn chế. Một lý do nữa cũng cần được đề cập đến là sự xuất hiện các
đột biến ngẫu nhiên tại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo ra sự khác biệt
về phổ thu được từ các mảnh cắt.
b. Phân tích ADN nhiễm sắc thể:
Phương pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm
sắc thể và cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật
với nhau. Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ
nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ học. Nói chung các mảnh
cắt nên có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh cắt
đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện
đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, mặt
khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết
quả phân tích, để khắc phục nhược điểm trên người ta phải thực hiện
phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát hiện các nguồn
ADN tạp nhiễm lẫn vào kết quả phân tích.
+ Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong
trường điện thay đổi, PFGE)
- Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử
lý trước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết quả
phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích
thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có
thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-
Field Gel Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz va
Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại
kỹ thuật này, tuy có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các
phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả
năng di động của các mảnh ADN có kích thước lớn trong điện trường, do
đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương
pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo phương pháp thông thường
thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh ADN có kích thước
khác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi. Kết quả ở
đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose,
tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE lực làm
thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn
đến các mảnh ADN có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động.
Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di
động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự
di động khác nhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ
không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường,
hình 1.2.
khoảng 0.5-20 µg ADN là thích hợp. Nếu quá nhiều ADN thì không thể
phân tích được, còn quá ít thì cũng không thể phát hiện được các băng
ADN trong kết quả phân tích. Mẫu ADN dùng cho kỹ thuật PFGE có thể
được giữ 1 năm trong lạnh có chứa 0.5M EDTA.
- Sau khi thu được ADN NST trong mẫu LMT agarose thì tiến hành
xử lý với enzym giới hạn loại có ít điểm cắt. Tuy nhiên mẫu đầu tiên
phải được xử lý với PMSF để bất hoạt protein K sau đó PMSF lại phải loại
bỏ sau một số lần rửa với chất tẩy rửa và EDTA. Sau đó chỉ cần phân
nhỏ mẫu trong agarose được xử lý với đệm và enzym cắt hạn chế qua
đêm trong tube và sau đó toàn bộ mẫu này được sử dụng để tách trong
trường xung điện. Bảng 1.2 dưới đây liệt kê các enzym cắt hạn chế
được dùng cho phân tích PFGE.
Bảng 1.2. Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE.
Enzym Vị trí cắt
AatII GACGT/C
ApaI GGGCC/C
ClaI AT/CGAT
MluI A/CGCGT
NarI GG/CGCC
NheI G/CTAGC
NotI GC/GGCCGC
NruI TCG/CGA
PvuI CGAT/CG
SacII CCGC/GG
SalI C/TCGAC
SfiI GGCC(N)4/NGGCC
SmaI CCC/GGG
XhoI C/TCGAG
Carruba et al (1991)
Heizen et al (1990)
Haertl ADN BADNlow (1993)
MirADNa et al (1991)
Bohm ADN Karch (1992)
Brosch et al (1991)
Herrmann et al (1992)
Zhang et al (1992)
Bygraves ADN Maiden (1992)
Boukadida et al (1987)
Sodati ADN Piffaretti (1991)
Prevost et al (1992)
Single ADN Martin (1992)
Mỗi một đối tượng có đặc trưng riêng về kết quả phân tích PFGE
và được dùng cho nghiên cứu so sánh với nhau về sự tương đồng. Đối
với nhiều đối tượng có nhiễm sắc thể thì không nhất thiết phải thực hiện
đối với mọi nhiễm sắc thể mà chỉ cần trên một số nhiễm sắc thể mà
thôi. Ví dụ trong trường hợp của C.albicans Monod (1990) chỉ cần thực
hiện phép phân tích với một trong 4 tổ hợp của một số nhiễm sắc thể là
đủ. Cho dù theo các cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác nhau thì kết quả
của phép phân tích PFGE đều giống nhau. Phép phân tích PFGE được
ứng dụng cho các nghiên cứu ở mức độ loài với loài.
Một số điểm cần lưu ý khi sử dụng kỹ thuật PFGE:
+ Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ
thuật cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó
khăn trên một số đối tượng vi sinh vật.
+ Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ
giữa các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể
giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn.
sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Bắt
đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất (kiềm) hay biến tính
nhiệt, lúc này hai sợi đơn ADN tách nhau được gọi là trạng thái biến
tính ADN (denature). Nếu tại thời điểm này người ta cho vào một ADN
đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện
(renature), lúc đó sẽ cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các
sợi đơn của mẫu ADN ban đầu (target ADN). Mức độ lai sẽ phụ thuộc
vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng như
điều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện
mẫu dò, kích thước mẫu dò). Như vậy, việc chọn điều kiện chính xác
cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính đặc hiệu của kết quả
phép lai. Sau khi lai, bước tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại
mẫu dò dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theo phương
pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh
giá mức độ tương đồng của phép lai.
Nói tóm lại một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai là:
mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai và điều kiện
tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai.
+ Chọn mẫu dò:
Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. Nhìn chung
các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu
dò. Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí
chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với
ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong
mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là
đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu phân tích để phân biệt với các
sinh vật khác. Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh nghiệm, mẫu
dò đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene mã
hoá cho một đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể là yếu
tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó trên
32
P
35
S
Alkaline phophatase
Ethidium
Fluorescein
Horseradish peroxidase
Microperoxidase
Southern (1975)
Collins& Hunsaker (1985)
Renz&Kurz (1984)
Albarella & ADNerson(1986)
Amman & ctv (1988)
Urdea ctv(1988)
Heller& Shneider(1983)
Nitrobenzofuran
Tetramethylorhodamine
Draper (1984)
Amman&ctv(1990)
Hình 1.3. Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) và gián tiếp (B)
· Đánh dấu gián tiếp:
Đánh dấu gián tiếp được thực hiện theo 3 bước: thực hiện phép
lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và
protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo (reporter) và
cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu.
al (1990)
Morrisey
& Collins
(1989)
Tchen et
al (1984)
Mặc dù có nhiều hệ thống đánh dấu và phát hiện tín hiệu nhưng
kinh nghiệm cho thấy hệ thống biotin và digoxidenin cho độ nhạy cao
hơn cả. Hai hệ thống này có thể phát hiện tới mức dưới picrogam acid
nucleic. Trong trường hợp với biotin thì đôi khi có mức độ nhiễu nền cao
do biotin có mặt trong các sinh phẩm, còn đối với digoxigenein thì có
thể không gặp khó khăn này.
+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ:
Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ
biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là
32
P và
35
S. Kết quả của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát
hiện trên X-phim hoặc nhấp nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương
pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt tới dưới mức picrogam
ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích
hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu
vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người
sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và
cá nhân sử dụng cũng như việc quản lý chất thải.
Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm
đến các phương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một
hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất
* Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên
cơ sở giải phóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate
(Miska và Geiger., 1987). Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang
được sử dụng rộng rãi.
2, Phương pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu:
Phương pháp đo màu có thể thực hiện trên môi trường dịch thể
hay chất mang và khá nhạy so với phương pháp phát quang. Người ta
đã tạo ra các cơ chất sinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như
Alkaline phosphatase). Lợi thế của phương pháp này là việc phát hiện
đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng trong
các phòng thí nghiệm vi sinh vật.
Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu
bằng cách thêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống. Một
ví dụ cho điều này là vai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP
thành NAD do Alkaline phosphatase trong hệ thống phát hiện mẫu dò
nucleic. Trong hệ thống này thì NAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy
hoá mà có sự tham gia của alcohol dehydrogenease và diaphorase.
Trong mỗi một chu trình thì NAD sẽ bị khử thành NADPH + H
+
. Phản
ứng oxy hoá này lại kèm theo phản ứng oxy hoá mà NADPH + H
+
lại bị
oxy hoá thành NAD, mọi phản ứng xảy ra gắn liền với việc khử ρ-
indonitro-tetrazolium màu tím thành formazan. Sản phẩm cuối cùng
formazan được định lượng bằng phép so màu (Self. 1985).
3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời
gian.
Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy
và có thể phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói
mẫu phải được xem ngay hoặc được bảo quản trong tối trong thời gian
6 tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu cho RNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vì
có tới hàng ngàn bản copy của RNA trong mỗi tế bào (Stahl và Amman,
1991).
Lai trong môi trường dịch thể:
Phản ứng lai trong môi trường dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so
với môi trường có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử ADN đích và
mẫu dò đều có thể di động tự do trong môi trường do đó phản ứng đạt
kết quả cao nhất. Nói chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì
thời gian kết thúc nhanh hơn từ 5-10 lần so với trong điều kiện là chất
mang (Bryan, et al., 1986). Tuy nhiên, cũng có thể bổ sung thêm chất
mang làm tăng phản ứng lai. Cần thêm bước cuối cùng là tách phức hợp
mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có thể
tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế
mức độ nhiễu của nền cho thích hợp.
Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trường dịch thể.
Trên thực tế hầu hết các KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật
đều tiến hành trong môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên
được phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò.
Sau đó là bước lai và tách phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các
thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu
kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; một
đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là mẫu dò.
Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù
chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo nguyên
tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vào trong dung dịch có các
đoạn ADN đích nghiên cứu. Như vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò
đánh dấu để phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích
gắn vào chất mang đã được hình thành. Phức hợp này được tách ra khỏi
dung dịch và khi có mặt cơ chất thích hợp để phát hiện được mẫu dò
được điện di trên gel agarose và tạo ra dấu vân (finger print) của nhiễm
sắc thể. Sau khi điện di gel được đặt dưới màng nitrocellulose hay màng
nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy lọc phía trên được đặt trên
cùng phần gel và màng kẹp giữa giấy lọc như trong hình 1.6.
Hình 1.6. Mô tả phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật
Southern Blot.
Kết quả là đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên
trên. Điều đó giúp cho việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và
bám chặt vào màng với kích thước và phiên bản đúng như trên gel sau
khi điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook 1989).
Phương pháp truyền thống này cũng được cải tiến khi dùng màng
nylon để chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985).
Thời gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố định ADN trên
màng được thực hiện sau đó bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV như đã
trình bày ở trên. Tuy nhiên, nhiều phương pháp cải tiến được thực hiện
nhanh như chuyển bằng điện di (Bittner, Kupfere, Morris, 1980) hay sử
dụng bơm chân không (Medveczky, 1987; Olszewsk, 1988).
Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose
lên màng thì trước tiên gel phải được xử lý biến tính và được làm trung
hoà trở lại. Gel được đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình
1.7).
Hình 1.7. Minh hoạ bước chuyển ADN lên màng.
Sau đó nguồn điện được nối và lúc đó ADN sẽ được chuyển lên
màng. Thời gian chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN nhưng
thường dao động trong khoảng 1-3 giờ. Phương pháp có thể thực hiện
theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm ngang. Hiện nay có một số thiết
bị bán trên thị trường được dùng cho kỹ thuật này. Với thiết bị nằm
thẳng đứng, thì toàn bộ được ngâm trong đệm và có thể tăng cường độ
dòng điện (chú ý vì có thể làm tăng nhiệt độ), phương pháp này cần
1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào
đó: ví dụ rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung
cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh
dấu phóng xạ hay với các cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu
dò này ở chỗ phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng
lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn
khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống
nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thì lại thu
được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping.
2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không
xác định (Tompkins et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho
các loài có chứa chính các đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu dò này đôi
khi rất có ý nghĩa trong việc phân biệt các mẫu sau khi tiến hành
phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990).
3. Một cách khác nữa cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một
đoạn ADN tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá
cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas
aeruginosa (Ogle et al., 1987). Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố
Cholera được dùng để xác định các typ cho các chủng thuộc họ phảy
khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989). Việc sử dụng bất kỳ loại
mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa cho so
sánh giữa các chủng với nhau.
Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu
trú phần gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ gene.
Bảng 1.6. Kết quả thu được khi thực hiện kỹ thuật RFLP với dùng các
Copyright: Tài liệu đại học ©