BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

--------------------------

NGUYỄN HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG
VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG
VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114


APW

Alkaline Pepton Water

bp

Base pair

CFU

Colony-Forming Unit

DNA

Deoxyribonucleic acid

IPTG

isopropyl-β-D-thiogalactoside

kb

Kilobase pair

LB

Luria - Bertani

NB


X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ......................................... 6
1.1.1. Phân loại........................................................................................................ 6
1.1.2 Đặc điểm ........................................................................................................ 7
1.1.3. Cấu trúc gen .................................................................................................. 9
1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ....................... 10
1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống........................................... 10
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn ............................... 10
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .................................... 11
1.2. Hoạt chất pyocyanin....................................................................................... 12
1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen .......................................... 12
1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin ........................................................ 13
1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin ............................................................ 14
1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi............................................... 15
1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi ..................... 15
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm ................................................ 15
1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh:......................................................................... 15
1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ..................................................................................... 17

2.2.2.2. Phương pháp PRC khuếch đại gen........................................................ 30
2.2.2.3. Phương pháp điện di.............................................................................. 32
2.2.2.4. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR ................................................. 33
2.2.2.5. Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) ................................. 34
2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen ............................................................... 36
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 38
3.1 Kết quả phân lập và xác định P. aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật 38
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. aeruginosa trên môi trường King A ............ 38
2


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

3.1.2 Kết quả nhuộm Gram................................................................................... 39
3.1.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính enzyme ........................................................ 40
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh ..................................................... 41
3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử ..... 42
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................. 42
3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA): ........................................ 43
3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA ....................................................................... 44
3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA ............................ 45
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn .......................... 47
3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của
P.aeruginosa PS39 ................................................................................................. 51
3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn
và nồng độ hoạt chất. ............................................................................................ 51
3.3.2. Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt
chất PCN ............................................................................................................... 54

phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotic kiểm soát sinh học đối
với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trong nuôi trồng
thủy sản. Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loại sắc tố là các
hợp chất có tính kháng khuẩn. Trong đó, các hợp chất phenazine do Pseudomonas
sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng.
Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyanin
PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) và phenazine1-carboxamide. Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằng
chloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh. Nghiên cứu tách chiết, tính chất và
ứng dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới:
4


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn
Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác
định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnh
trong nuôi trồng thủy sản [66]. Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tính
kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V. parahaemolyticus , V. vulnificus , V.
alginolyticus , V. fluvialis , V. Proteolyticus, V. harveyi và do đó nó có thể được
ứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.
Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh
hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằm mục đích
phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio gây
bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tôm nuôi ở Việt
Nam.
Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là:
1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vi


Proteobacteria

6


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Lớp (class)

Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo)

Pseudomonadales

Họ (familia)

Pseudomonadaceae

Chi (genus)

Pseudomonas

Loài (species)

Pseudomonas aeruginosa


nhưng không tan trong chloroform. Môi trường King B được sử dụng để phát hiện
sắc tố pyoverdin. Ngoài P. aeruginosa còn có các vi khuẩn như P. fluorecens, P.
pytida, P. veroni, P. monteilla cũng có khả năng sinh sắc tố này.
- Pyorubin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh ra sắc
tố này.
- Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng P. aeruginosa sinh sắc
tố này.
Tuy nhiên không phải tất cả các chủng Pseudomonas đều sinh sắc tố, khoảng
5- 10% số chủng Pseudomonas không sinh sắc tố. King, Ward, và Raney đã tìm ra
môi trường thạch Pseudomonas Agar P (môi trường agar King A) để tạo điều kiện
cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường
agar King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein.[58]
P. aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai
và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy in vitro. Các dấu
hiệu nhận biết sự có mặt của P. aeruginosa trong lâm sàng thường bao gồm khả
năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại
nhiệt độ 42°C. P. aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu
máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon, và gây
ra sự ăn mòn vi thể.[14]
Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn được
xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi
trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng
cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat
8


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang


Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác
định các vi khuẩn nói chung. Trong phương pháp vi sinh vật học, người ta nghiên
cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các loài vi khuẩn. Đặc điểm
hình thái của một loài vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào (hình dạng, nội
bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc (màu sắc, đường
kính, hình dáng). Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sự phát triển của các vi
sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn năng lượng, hay các điều
kiện môi trường khác. Tiếp đó là sự phát triển của chúng trên các kháng sinh khác
nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổi chất…
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác
cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở
mức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1].
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so
sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu
phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của
các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có khả năng xác định,
có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy
nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát
sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật.
10


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S
rRNA thì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay.
Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, do có kích thước nhỏ

khỏe và hệ miễn dịch của tôm bạc gân Penaeus latisulcatus khi cho tôm ăn với liều
lượng 105 CFU/ml. Vi khuẩn P. aeruginosa YC58 cũng liên kết hoạt động với hệ
vi sinh của ấu trùng hàu Cortez, C. Corteziensis, giúp gia tăng tỷ lệ sống và tăng
trưởng của hàu ngọc Pinctada mazatlanica. Ngoài ra, khi kết hợp vi khuẩn P.
aeruginosa và B. cepacia cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ
sống của điệp N. subnodosus[97].
1.2. Hoạt chất pyocyanin
1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen
Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trình nuôi
cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tố nâu,
Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khả năng
kháng khuẩn. Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tự nhiên
như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó được chuyển
đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuối cùng
đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37]. Việc sinh tổng hợp
phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42, 43, 45, 46].
Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thành phenazine.
Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểm phân nhánh
cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62].
Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước và
chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Các sắc tố
pyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine. Pyocyanin được
kết tinh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine. Trong quá trình
tổng hợp pyocyanin, bảy gen của P. aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC,
D, E , F, G , M và S. Locus sinh tổng hợp phenazine đã được tìm thấy trong tất cả
loài, phzM và phzS là các gen chịu trách nhiệm chính để chuyển đổi phenazine -112


Luận văn thạc sỹ


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

khuẩn. Gần 90-95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P. aeruginosa là do
pyocyanin. Nó cho thấy khả năng kháng lại các loài vi khuẩn gây bệnh như
Salmonella paratyphi, E. coli và Klebsiella gây bệnh viêm phổi [81]. Pyocyanin
phân lập từ P. aeruginosa 4B cho thấy khả năng kháng sinh chống lại tác nhân gây
bệnh khác nhau và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như Bacillus cereus.
Các sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa pyocyanin trong môi trường đã
được chọn lọc và chứng minh tác dụng kháng khuẩn trên các sinh vật như S.
aureus, Staphylococcus lớp biểu bì, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và
Saccharomyces cerevisiae. Các sắc tố được sản xuất cho thấy khả năng chống lại
các sinh vật như vi khuẩn E. coli, Acinetobacter , S. aureus và Streptococcus gây
bệnh viêm phổi rất hiệu quả (Thụy Điển năm 2010).
1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin
Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin được tiến hành ở
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012);
Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat
Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75],
chống nấm [55] và các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66]. Tác giả
Prabhakaran Priyaja [74] đã thông báo khi khảo sát tính kháng của PCN với
Vibrio sp cho thấy khả năng ức chế 7 loại Vibrio: V. harveyi, V. parahaemolyticus,
V. vulnificus, V. alginolyticus, V.fluvialis, V. mediterrani và V. nereis với vòng
kháng khuẩn từ 13,5 đến 31,0mm. Khi dùng dịch nuôi của P. aeruginosa có hàm
lượng PCN là 30mg/l cho vòng ức chế đạt 17,50 – 38,06mm. Nồng độ ức chế tối
thiểu của pyocyanin chống lại các vi khuẩn và nấm dao động ở 20-120 µg /ml PCN
[15, 31, 39, 40, 63]. Khả năng kháng E. ictalluri kém hơn. Mức dộ ảnh hưởng đối
với một số chủng không gây bệnh như LA5, B. clausii tương tự như khi sử dụng
kháng sinh TE.

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

xanh (Callinectes sapidus). Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm
châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus… hay tôm hùm châu Á
(Panulirus homarus, P. ornatus...) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio.
Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981.
Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ
thân có liên quan đến thức ăn thối rữa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu
và hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp
(công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độc trong ao.
Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do
tôm ăn Artemia và tảo giả. Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản
3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú.
Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt
Nam. Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes
irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h [3].
Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã phát
hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong cá trại sản
xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm [2]. Những năm gần đây khi mà
nghề nuôi các động vật thân mềm nước mặn phát triển thì bệnh Vibriosis đã trở
thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản.
Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều
gây ra một số dấu hiện bệnh lý nhất định. Cho đến nay, một số tác giả cho rằng
Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm. Ngược lại một số tác giả lại
cho rằng: Vibrio là tác nhân thứ hai. Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều
kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương
hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong nghiên cứu bệnh động vật thủy sản
phân lập Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong

nhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm
giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở
thành bể hay dưới đáy ao.
17


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

b, Mùa vụ xuất hiện bệnh
Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm
nuôi. Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp, tìm
thấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ương tảo
và bể ương Artemia.
Nhìn chung, vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 – 40ppt
(phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng),
phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7-9.
Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao
hơn tầng mặt. Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào
các thời điểm biến động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nước
của thủy triều (nước cường, nước ròng) [2].
c, Tác hại của bệnh
Bệnh do Vibrio sp. gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính,
trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể là 100%.
1.3.3. Các phương pháp phòng ngừa và điều trị
1.3.2.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp
a,Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi
Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc
rửa chua) và khử trùng ao nuôi với mục đích là:

tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách cho ăn theo phương pháp “4
định”: định chất lượng, số lượng thức ăn, vị trí và thời gian cho ăn.
1.3.2.2. Điều trị
- Khi tôm bị nhiễm bệnh có thể sử dụng các loại thuốc kháng sinh như
Furacin, Oxytetracylin, trộn vào thức ăn cho ăn liên tục 5-7 ngày.
- Dùng một số kháng sinh trị bệnh cho ấu trùng tôm: Oxytetracylin,
Bacitracin, Rifamycin, Erytromycin [4, 5, 7, 8].
Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn gây bệnh cho tôm đã có tính đa kháng thuốc
cao, việc sử dụng kháng sinh kém hiệu quả và hạn chế. Trong một nghiên cứu khả
19


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Huyền Trang

năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu
trùng tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy 100%
chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15% kháng
với trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol, nitrofurantoin và
norfloxacin. Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại kháng sinh. Số
chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15%. Có một chủng kháng 4 loại và một
chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [6]. Chính vì vậy, giải pháp tìm
kiếm các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên là vô cùng quan trọng và cần thiết.

20


Luận văn thạc sỹ