ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH
QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON
TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ: 60440118

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

HÀ NỘI, 2015





MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ---------------------------------------------------------------------------------------1
Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU -----------------------------------------------3
1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon ------------------------------------------3
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon -----------------------------------------3
1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính ------------------------------------------------------5
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon ----------------------6
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước-------6
1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới ------8
1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon ------------ 10
1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) --------------------------------------- 10
1.3.2 Phương pháp vi sinh vật---------------------------------------------------------- 11
1.3.3 Phương pháp hóa lý -------------------------------------------------------------- 13
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ------------------------------------------------------------------ 21
2.2 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ------------------------------------------------- 22
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 22
2.2.2 Nội dung nghiên cứu -------------------------------------------------------------- 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 21
2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon ------------------- 21
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu ------------------------------------------------------------ 23
2.3.3 Xử lý số liệu ------------------------------------------------------------------------ 23
2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu -------------------------- 23
2.4.1. Thiết bị và dụng cụ --------------------------------------------------------------- 23
2.4.2 Hóa chất, chất chuẩn ------------------------------------------------------------- 24

ii



Bảng 3.6: Bước sóng kích thích và phát xạ 07 chất phân tích ...........................29
Bảng 3.7: Chương trình gradient dung môi pha động tối ưu .............................36
Bảng 3.8: Phương trình hồi qui và hệ số tương quan của các chất phân tích ....37
Bảng 3.9 : So sánh diện tích píc dung dịch chuẩn bay hơi và không bay hơi ....39
Bảng 3.10: So sánh độ thu hồi giữa cột SPE C18 và cột HLB ..........................40
Bảng 3.11: Độ thu hồi theo thể tích mẫu nước ban đầu .....................................43
Bảng 3.12: Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với nền mẫu nước ............51
Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến ...................................................................52
Bảng 3.14 : Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu nước thêm chuẩn ...........................53
Bảng 3.15: Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu tôm thêm chuẩn .............................54
Bảng 3.16: Danh sách mẫu nước phát hiện chứa tồn dư kháng sinh .................55

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon .......................................................................... 3

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon ........................................... 3
Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon .................................... 4
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon trong nước và trong tôm .................. 23
Hình 3.5: Phổ hấp thu và phát xạ của 07 chất phân tích........................................28
Hình 3.6: Kết quả khảo sát với 3 hệ dung môi ......................................................30
Hình 3.7: Sắc ký đồ OA và FMQ tại tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút ..............32
Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký theo pH của dung dịch đệm pha
động .......................................................................................................................33
Hình 3.9: Sắc ký đồ 07 chất phân tích ở 3 nồng độ đệm .......................................34
Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 07 chất nhóm quinolon ................................................35
Hình 3.11: So sánh diện tích pic các chất khi dùng các dung dịch rửa cột SPE ...41
Hình 3.12: Độ thu hồi theo thể tích rửa giải ..........................................................42


DFLX

Difloxacin

DNFX

Danofloxacin

DAD

Diot Array Detector

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Phương pháp miễn dịch enzym (enzyme-linked immunosorbent
assay)

ERFX

Enrofloxacin


Chiết cation hỗn hợp (Mixed-phase cation)

NRFX

Norfloxacin

vi


MRL

Mức dư lượng tối đa (Maximum Residue Levels)

MeOH

Methanol

MeCN

Acetonitrile

MS

Khối phổ (Mass Spectrophotometer)

MBFX

Marbofloxacin

OFLX

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(Ultra performance liquid chromatography)

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation)

Ex

Bước sóng kích thích (ExcitationWavelenght)

Em

Bước sóng phát xạ (EmissionWavelenght)

vii


MỞ ĐẦU
Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội,
của mọi quốc gia trên toàn thế giới. Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không
những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất
lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội...
Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải
sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Tác
hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều
nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai,
gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng
sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng


2


Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon
Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa
nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn
xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các
nhóm thế. Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm
F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54].

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon
Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính
acid. Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base. Chúng tan
trong lipid và thấm được qua màng tế bào. Có thể chia nhóm quinolon thành hai
loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ)
- Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9. Trong
nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những
quinolon thuộc thế hệ thứ nhất.
- Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2
khoảng 7,2–8,9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation,
dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin,
ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic.

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon
3



4

Sarafloxacin

pKa1: 5,6
pKa2: 8,2

5

pKa1: 5,7 – 6,1

Difloxacin

pKa2: 7,2 – 7.6

6

Oxolinic acid

pKa: 6,9

7

Flumequine

pKa: 6,5

4



Tên kháng sinh
Lợn (ppb)
Bò, dê, cừu(ppb)
Danofloxacin
100
200
Difloxacin
400
400
Enrofloxacin
100
100
Flumequin
200
200
Marbofloxacin
150
150
Oxolinic acid (*)
100
(*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb

Gà(ppb)
200
300
100
400
100

Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014

enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin.
Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT

Tên kháng sinh
ADI (μg/kg thể trọng/ngày)
MRL (μg/kg)
Danofloxacin
0 - 20
50 (gan lợn); 100 (thịt)
Enrofloxacin
0-3
100
Flumequine
0 - 30
500 (thịt, gan, cá)
Sarafloxacin
0 - 0,3
10 (thịt); 80 (gan, thận)
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước
Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản
lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực

6


phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này. Việc tồn dư
kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian
dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly
hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch.

hơn norfloxacin từ 3-5 lần [2].
Năm 2014, cũng theo nghiên cứu của TS. Dương Thị Hồng Anh và cộng sự,
đối với các mẫu nước, bùn, tôm được lấy tại các điểm trong ao nuôi, dọc kênh và
rừng ngập mặn tiếp giáp ở khu vực nuôi tôm quảng canh thuộc xã Giao An, Giao
Thủy, Nam Định vào hai thời điểm thả tôm giống và thu hoạch. Dư lượng kháng
sinh CPFX và norfloxacin (NRFX) được phân tích trong các mẫu sử dụng phương
pháp chiết pha rắn, chiết lỏng áp suất cao và xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao với detector huỳnh quang. Chỉ có dư lượng ciprofloxacin được tìm thấy trong
nước và bùn ở các khoảng nồng độ lần lượt là 0,06 – 0,35 µg/L và 0,22 – 0,40 µg/g.
Kết quả phân tích tại thời điểm đầu vụ nuôi tôm cho thấy người nuôi trồng đã sử
dụng CPFX để khử trùng nước và môi trường. Trong mẫu tôm sản phẩm thu tại khu
vực này không phát hiện thấy CPFX và NRFX [3].
1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tình hình sử dụng và tồn dư
kháng sinh nhóm quinolon ở mức độ báo động. Theo báo cáo năm 2006 của Tổ
chức đánh giá dược phẩm Châu Âu (European Medicines Evaluation Agency), tổng
lượng kháng sinh quinolon tiêu thụ và khối lượng sản phẩm thịt có chứa kháng sinh
nhóm quinolon tại một số quốc gia được thống kê như sau [27]:
Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon
Tên nƣớc

Cộng hòa Séc
Đan Mạch
Phần Lan
Pháp
Hà Lan
Tây Ban Nha
Thụy Điển
Anh


95830
1631000
364000
118524
136300
687000

409102
1762000
193222
2321000
1250000
315141
287500
690000

215802
199994
83730
2010700
564000
229335
99850
1569987

8

Tổng
cộng
728679

Các nghiên cứu về kháng sinh trong môi trường cho thấy sự có mặt của các
chất này ở rất nhiều các khu vực khác nhau, nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Trung
Quốc nguồn nước cấp cho sinh hoạt [56], nước vùng cảng, nước sông [53], nước
thải bệnh viện đã qua xử lý [55] đều thấy có sự hiện hiện ở hàm lượng cao kháng
sinh nhóm quinolon.
Ngay tại Mỹ, một quốc gia phát triển có sự quản lý chặt chẽ về nguy cơ ô
nhiễm môi trường, nghiên cứu của H. Nakata và cộng sự năm 2004 cũng phát hiện
có ofloxacin trong mẫu với hàm lượng cao nhất là 204ppb. Trong nghiên cứu của
mình, tác giả cũng đã so sánh kết quả phát hiện với một số quốc gia Châu Âu trong
9


các nghiên cứu tương tự. Theo đó mức phát hiện OFLX và lomefloxacin (LMFX) ở
các quốc gia như Pháp (330–510ppb; 180–290ppb), ở Ý (290–580ppb; 180–
320ppb), ở Hy Lạp (460ppb; 290ppb) [33].
Tại Canada, kết quả khảo sát tại 8 hồ xử lý nước thải cho thấy chỉ có 40%
lượng kháng sinh nhóm quinolon giảm xuống sau khi xử lý. Mẫu sau xử lý được
thải trực tiếp ra môi trường vẫn chứa hàm lượng trung bình của CPFX và OFLX lần
lượt là 146 và 179ng/L [32].
1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon
Nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất nhóm quinolon như:
phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật
học), phương pháp lý hóa. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng.
1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)
Với ưu thế thời gian phân tích ngắn, các thao tác thí nghiệm đơn giản, có thể
thực hiện tại hiện trường, phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng
nguyên-kháng thể đã trở thành một công cụ khá hiệu quả và được các cơ quan thẩm
quyền chấp thuận cho phép sử dụng với lục đích sàng lọc. Liên minh Châu Âu (tại
Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích sàng
lọc dư lượng các hóa chất kháng sinh cấm.

vào môi trường trước và sau khi thêm mẫu phân tích. Những mẫu có chứa kháng
sinh sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không làm đổi màu chất chỉ thị. Ngược
lại đối với mẫu không chứa kháng sinh hoặc chứa với lượng nhỏ hơn giới hạn phát
hiện, sau thời gian ủ vi khuẩn phát triển làm thay đổi điều kiện môi trường khi đó
màu của chất chỉ thị sẽ khác so với màu sắc ban đầu. Tùy thuộc vào loại vi khuẩn sử
dụng mà thời gian phát hiện nhanh hay chậm.
Nghiên cứu của David Sanz [23] sử dụng test Explorer (ZEULAB, Zaragoza,
Spain) ức chế vi khuẩn G. stearothermophilus để định tính các kháng sinh có mặt
trong các mẫu thịt. Trong test này, mỗi giếng sẽ chứa môi trường thạch aga và vi
khuẩn đích trong sự có mặt của chất chỉ thị pH. Khi test được ủ trong điều kiện
650C các bào tử sẽ phát triển sinh ra môi trường axit và làm đổi màu chất chỉ thị từ
xanh sang vàng. Khi mẫu có chứa các chất ức chế vi khuẩn (các kháng sinh chẳng
hạn) vi khuẩn sẽ không phát triển được do đó môi trường pH không thay đổi.
Nghiên cứu cũng sử dụng test Equinox (ZEULAB, Zaragoza, Spain) đặc hiệu đối
với kháng sinh nhóm quinolon trong nền mẫu thực phẩm. Khác với test Explorer,
11


test Equinox dựa vào sự ức chế phát triển của vi khuẩn E.Coli ATCC 11303. Chất
chỉ thị được sử dụng cho test này là chỉ thị oxy hóa khử. Nguyên tắc hoạt động của
test là khi ủ ở nhiệt độ 37°C các tế bào vi khuẩn sẽ tăng sinh làm thay đổi điện thế
khử của môi trường, nhờ đó chất chỉ thị sẽ chuyển màu (từ xanh sang nâu hoặc vàng
cam). Với những mẫu có chứa tồn dư kháng sinh nhóm quinolon lớn hơn giới hạn
phát hiện sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli do đó màu của môi trường sẽ
không thay đổi
Phương pháp này đã được tác giả Godelieve Okerman và cộng sự sử dụng để
phân tích tồn dư của 10 quinolon trong các mẫu thịt gia cầm và cá: ERFX, DNFX,
marbofloxacin (MBFX), SRRFX, NRFX, flumequine (FMQ), oxolinic acid (OA),
nalidixic acid (NA), difloxacin (DFLX), ciprofloxacin (CPFX). Ba loại vi khuẩn
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus ở hai điều kiện pH=6 và pH=8 đã

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy sử dụng phương pháp
vol–ampe hòa tan hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân treo, kĩ thuật quét sóng
vuông để xác định CPFX trong các mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu đã được
xác định trên nền hệ đệm acetat 0,075M pH=3,8. Đường chuẩn xác định CPFX
trong khoảng nồng độ từ 0,01-0,22ppm với giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng cỡ ppb (LOD = 2,6ppb; LOQ=8,6ppb) [7].
1.3.3.2. Phương pháp trắc quang
Các quinolon xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính
tuân theo định luật Lambert – Beer trong khoảng nồng độ khác nhau tùy thuộc chất
nghiên cứu. Do cấu trúc có chứa vòng quinolon nên các kháng sinh nhóm quinolon
có khả năng hấp thu trực tiếp tia sáng tại vùng bước sóng tử ngoại hoặc có thể tạo
phức màu với các tác nhân phù hợp.
Với ưu thế nhanh, đơn giản và sử dụng các trang thiết bị rẻ tiền phương pháp
trắc quang được sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm để xác định các
quinolon ở hàm lượng lớn. Nghiên cứu mới đây của tác giả Edith Critina sử dụng
phương pháp đo trực tiếp độ hấp thu quang tại bước sóng 275nm để xác định hàm
lượng ciproxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt. Khoảng tuyến tính của đường
chuẩn được xác định từ 2,0–7, µg/mL với độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng từ
1,55 đến 2,47% (n=6) [25]. Cũng tương tự như nghiên cứu trên, tác giả Affo lại sử
dụng bước sóng hấp thu ở 326nm để xác định trực tiếp hàm lượng ciproxacin trong
13


dịch truyền cho độ tuyến tính tốt với khoảng xác định từ 0,002 – 0,012 mg/mL
[14]. Với levofloxacin tác giả Mahfuza tiến hành đo ở bước sóng 292nm trên nền
dung dịch nước:methanol(MeOH):MeCN (9:0.5:0.5) với khoảng tuyến tính từ 1,0–
12,0 μg/mL [43].
Ngoài phương pháp đo trực tiếp các nghiên cứu cũng sử dụng các chất tham
gia phản ứng tạo phức với các quinolon. Trong nghiên cứu của Samia Mostafa đã sử
dụng 3 tác nhân tạo phức khác nhau để xác định CPFX, ERFX và pefloxacin trong

của 2-propanol : nước : formic acid (50:49:1,v/v). Các điều kiện khối phổ được tối
ưu hóa như sau: điện thế mao quản -4kV, áp lực khí phun 10psi, tốc độ khí làm khô
6L/phút, nhiệt độ khí làm khô 1500C [28].
1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong việc xác định các kháng
sinh nói chung và kháng sinh nhóm quinolon nói riêng là phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao. Phương pháp dựa trên quá trình quá trình tách xảy ra trên cột
tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏngrắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi
tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và
pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích do cấu trúc phân tử của các chất khác
nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau chúng
di chuyển với tốc độ khác nhau nhờ đó tách ra khỏi nhau [11]. Các chất sau khi
được tách ra khỏi cột sắc ký tùy thuộc vào tính chất của chúng sẽ được phát hiện
trên các detector phù hợp.
Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC: đại lượng đặc trưng cho quá
trình tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậy dựa vào thời gian lưu của chất
phân tích so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn ta có thể xác định sự có mặt của
chất trong mẫu phân tích (định tính). Ngoài ra do sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện
tích peak chất và nồng độ ta có thể so sánh với diện tích của dãy chất chuẩn để từ đó
xác định được hàm lượng chất phân tích có trong mẫu (định lượng).
Đối với các chất phân tích nhóm quinolon trong cấu trúc phân tử chứa vòng
thơm (vòng quinolon) với các liên kết bội do đó nó có khả năng hấp thụ tia UV (có

15


thể xác định bằng detector UV hoặc DAD, PAD), cũng nhờ vòng thơm này mà các
chất kháng sinh nhóm quinolon có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích
bằng tia sáng có bước sóng phù hợp (có thể xác định bằng detector huỳnh quang).
 Phương pháp HPLC sử dụng detector UV và DAD