Header Page 1 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

UNG THỊ NHƯ TRUYỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ CHUYỂN HOÁ
MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC
TỪ CÂY RAU MÁ [Centella asiatica (L.) Urban]

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 27

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng - 2012

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

Công trình ñược hoàn thành tại
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. TRẦN VĂN SUNG

Phản biện 1 : PGS.TS. LÊ THỊ LIÊN THANH
Phản biện 2 : PGS.TS. LÊ TỰ HẢI


ít ñộc hơn và thân thiện với môi trường. Người ta có thể sử dụng các hợp
chất thiên nhiên một cách trực tiếp ñể làm thuốc, hoặc sử dụng làm các mô
hình ñể nghiên cứu tổng hợp các thuốc mới.
Cây rau má là một trong những cây thuốc ñược sử dụng rộng rãi
trong y học cổ truyền ở các nước trong khu vực ñông Á như: Ấn Độ,
Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri lanka, Việt Nam…, do ñó ñã thu hút
ñược rất nhiều sự chú ý của các nhà hóa học. Các nghiên cứu thử nghiệm
trong ống nghiệm về các dịch chiết của cây rau má trong CHCl3 và etanol
95%, ñã cho thấy các dịch chiết này ñều có các hoạt tính sinh học ñáng
chú ý như: hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống
u và có tác dụng bảo vệ gan. Nguồn rau má mọc tự nhiên ở Việt Nam khá
dồi dào. Tuy vậy, cây chỉ ñược khai thác và sử dụng tại chỗ, chưa trở
thành mặt hàng thương mại hóa [1]. Thành phần hóa học chính của cây rau
má gồm các hợp chất triterpen và triterpen glucosid như axitasiatic,
asiaticosid, axitmadecassic, madecassoid, irahmosid, brahminosid. Ngoài
Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

2

ra cây rau má còn chứa tinh dầu với mùi thơm ñặc trưng, các hợp chất
polyacetylen, flavonoid, vitaminC, ancaloid và oligosacharid [1, 17].
Từ những lí do trên trong bản luận văn này chúng tôi ñặt nhiệm vụ “nghiên
cứu chiết tách và chuyển hoá một số dẫn xuất của axit asiatic từ cây rau
má [Centella asiatica (L.) urban] “
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Chiết tách và tinh chế axit asiatic từ cây rau má Việt Nam
- Chuyển hoá một số dẫn xuất

tinh,...
4.5. Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ
Các chất tinh khiết sau khi ñược phân lập và tinh chế sẽ ñược xác
ñịnh các hằng số lý hóa ñặc trưng như: màu sắc, nhiệt ñộ nóng chảy... Sau
ñó tiến hành ghi các phổ như:
- Phổ hồng ngoại (FT-IR) ñối với chất rắn ñược ño dưới dạng viên
nén KBr, ñối với chất lỏng ñược ño ở dạng màng mỏng (film).
- Phổ khối (ESI-MS) ñược ghi trong dung môi CHCl3 hoặc CH3OH.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng
chất nội chuẩn là TMS (δ = 0 ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6
ñược ghi ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và ở tần số 125 MHz cho
phổ 13C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất ñược xác ñịnh bằng sự kết hợp
các phương pháp phổ và so sánh tài liệu.
4.6. Phương pháp sinh học
Thăm dò hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp ñược tại phòng thử
hoạt tính của Viện Hoá học.
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Từ các kết quả nghiên cứu, luận văn ñã thu ñược một số kết quả với
những ñóng góp thiết thực sau:
- Đã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu ñể thực hiện qui trình chiết, tách
axit asiatic và axit madecassic từ cây rau má.
- Từ dịch chiết EtOH của rau má ñã phân lập ñược 3 chất sạch
- Đã tổng hợp ñược 4 dẫn xuất của axit asiatic trong ñó dẫn 41
(RMDV25mE) là chất mới.
- Cấu trúc của các chất trên ñã ñược xác ñịnh bằng việc kết hợp các

Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.


Footer Page 6 of 126.


Header Page 7 of 126.

5

Dân gian thường dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ ñậu,
sởi, sốt da vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm ñường tiết niệu,
ñái dắt ñái buốt, còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hư, bạch
ñới, giải ñộc lá ngón và nhân ngôn. Dùng ngoài trị rắn cắn, mụn nhọt, lở
ngứa và vết thương chảy máu.
Ở Trung Quốc, rau má ñược dùng trị cảm mạo, phong nhiệt, viêm
phần trên ñường hô hấp, viêm gan, lỵ, cúm, ăn phải vật có ñộc, viêm màng
phổi, rắn cắn, gai ñâm vào thịt, trúng ñộc nấm dại, ngộ ñộc sắn, trúng ñộc
thuốc nông dược, ngộ ñộc thức ăn và ñòn ngã tổn thương.
Từ những năm 1940, y học hiện ñại bắt ñầu nghiên cứu những tác
dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn
ñược gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic
acid và asiatic acid. Hoạt chất asiaticoside ñã ñược ứng dụng trong ñiều trị
bệnh phong và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi
khuẩn ñược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ
kháng nhiễm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch
chiết rau má có thể làm tan lớp màng bao nầy ñể hệ thống miễn dịch của
cơ thể tiêu diệt chúng. Tuy nhiên, ở nước ta các công trình nghiên cứu này
mới chỉ tập trung vào mặt thực vật học.
Trong số các loại rau má thì cây rau má có tên khoa hoc: Centella
asiatica (Linn) Urban, ñược sử dụng rộng rã trong các bài thuốc ñông y,
ñặc biệt rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới ñã nhiều năm nghiên cứu

Các phản ứng hóa học ñược thực hiện theo các phương pháp thông
dụng trong các phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ. Các phản ứng của các
chất nhạy cảm với hơi ẩm và không khí ñược tiến hành trong môi trường
có khí trơ. Các dung môi phản ứng ñược làm khan trong thiết bị chuyên
dụng.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA CÁC
CHẤT
Việc xác ñịnh cấu trúc hóa học của các chất sạch ñược thực hiện
thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện ñại như phổ hồng ngoại
(FT-IR), phổ khối (MS), sắc kí lỏng cao áp gắn với khối phổ (LC/MS),
phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như
1

H, DEPT, COSY, HSQC và HMBC. Trong trường hợp cần thiết sẽ ñiều

Footer Page 8 of 126.


Header Page 9 of 126.

7

chế dẫn xuất acetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl ñể khẳng ñịnh
thêm cấu trúc của chúng.
2.6. PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC
2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh
2.6.2.Phương pháp thử ñộ ñộc tế bào

CHƯƠNG 3
THỰC NGHIỆM

EtOH (2,5 lít). Thời gian rút dịch chiết là 2 tiếng/lần. Gộp dịch lại, quay
cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt ñộ 500C, thu ñược 165 gam cặn
EtOH. Cặn chiết thu ñược ñược chế thêm nước cất. Sau ñó chiết lần lượt
với n-hexan và chloroform. Các dịch chiết ñược cất loại dung môi cho ñến
khi khô sẽ thu ñược 20 gam cặn n-hexan, 25 gam cặn chloroform và 120
gam cặn dịch nước.
Các chất phân lập từ dịch chiết EtOH của cây rau má
Tên chất

Axit asiatic
(RM1)

Cấu trúc

Hiệu suất (so
với mẫu khô)
0,37%

Axit
Madecassic
(RM2)
Stigmasterol
glucoside
+ β-sitosterol

0,43%

0,096%

glucoside (RM3)


8

5

3

HO

10
6

4

23

7

27

15

21
22

18
H

1



HO

COOH

O

41

9. Axit siatic

OH

(CH3CO)2O/Py

COOH

AcO

HCl

COOH

AcO
HO

O

HO



Footer Page 11 of 126.

Cấu trúc


Header Page 12 of 126.

10

CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT
TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC
4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic và
axit madecassic
Chiết mẫu bằng EtOH 80% ở ba nhiệt ñộ khác nhau là 60, 70 và
800C.
Kết quả ñược ñưa ở bảng 4.1. Kết quả cho thấy chiết ở 800C cho hiệu
quả tốt hơn cả với hàm lượng axit asiatic và axit madecassic là 0,52% và
0,77% tương ứng.
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiêt ñến hàm lượng axit asiatic và axit
madecassic
Lượng

Nhiệt ñộ

Nồng ñộ

Axit asiatic


80

80

0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%)

4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit
asiatic
Nghiên cứu chiết mẫu rau má với ba nồng ñộ cồn là 70, 80 và 90% ở
nhiệt ñộ 800C. Kết qủa ñược ñưa ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết ñến hàm lượng axit
asiatic và axit madecassic
Lượng
mẫu (g)

Nồng ñộ
EtOH (%)

Axit asiatic trong
mẫu (g)

Axit madecassic
(g)

80

70

0,310 (0,39%)

axit madecassic thu ñược lại ít hơn. Điều này ñược lý giải là do tăng hàm
lượng nước, trong quá trình chiết các hợp chất ñường, muối vô cơ ..., sẽ
tan vào nhiều hơn, do ñó làm tăng lượng cặn và gây khó khăn trong việc
tinh chế, và không thu ñược triệt ñể lượng axit asiatic và axit madecassic
có trong cặn chiết.
4.1.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết
Sau khi chọn ñược nồng ñộ dung môi chiết tốt nhất là 80%, chúng tôi
khảo sát thời gian (1, 2 và 3 giờ). Chọn nhiệt ñộ 800C. Lọc dịch chiết, cất
loại trên bộ quay cất chân không dưới áp suất giảm thu ñược cặn tương
ứng (Bảng 4.3 ).
Bảng 4.3: Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô
Lượng mẫu (g)

Thời gian chiết (giờ)

Tổng cặn chiết (g)

80

1

10,36

80

2

13,21

80

Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 9 có mặt của 30 cacbon trong ñó có
6 nhóm metyl; 9 nhóm cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm
cacbon bậc 4, nhóm carboxylic với δ = 181,6 ppm và tín hiệu nối ñôi C-12
= C-13; δ = 139,8, 126,6 ppm. Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tương tác
giữa hai proton ở δH: 3,297 (d, J = 11Hz); 3,535 (d; J = 11Hz) gắn trực tiếp
với carbon ở vị trí C-23, proton ở δ = 3,387 (J = 9.5 Hz; H-3) tương tác với
proton ở δ = 3,718 (m, H-2). Phổ HSQC cho thấy rõ giữa H-2 (3,72 ppm)
và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38 ppm), tương tác giữa
C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả
phân tử tại m/z = 487.4 [M-H]+. Kết hợp với phổ 1H- và phổ 13C NMR dự
ñoán chất 9 có công thức phân tử là C30H48O5.
So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 9 với số liệu
của axit asiatic trong tài liệu [24, 25], thấy hoàn toàn trùng khớp. Do vậy
có thể kết luận chất 9 chính là axit asiatic, một trong các thành phần
triterpenoid chính của cây rau má.

Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

13

Hình 4.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 9
4.2.2. Chất (10) (RM2): Axit madecassic

- Phổ hồng ngoại của chất (10) cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng của nhóm
hydroxyl (3416,16 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930,19 và 2867,91 cm-1).
Phổ 1H-NMR cho thấy có 4 metyl singlet, hai metyl doublet tại 0,92
và 1,10 ppm. Ngoài ra trên phổ có các tín hiệu của nhóm hydroxymetin (CHOH) tại δH: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3); 4,4 (m, H-6); tín hiệu ở δH =



Header Page 17 of 126.

15
1

Bảng 4.4: Số liệu phổ H- và 13C-NMR của chất 9 và 10
TT
1

Chất 9 (RM1)
δC
δH (Hz)
48,0

2

69,7

3,71(1H,m)

69,4

3,64(1H, m)

3

78,2



19,1
33,6
40,7

18,5
32,9
40,2

68,4 4,4 (1H, m) 67,7 4,8 (1H,m)
41,2
41,1
39,7
39,7

9
10

48,5
38,9

47,9
38,3

48,7
38,1

48,8
38,1



43,8

43,2

15

29,1

28,6

28,8

28,8

16

25,3

24,8

24,5

24,8

17

48,7

48,4


39,7
30,9

40,4
31,6

39,6
30,9

22

38,1

37,4

38,5

37,4

23

66,3

24

13,9

14,2


29

24,1
181,5
17,8

23,8
180,8
17,3

23,9
181,6
17,6

23,8
180,8
17,3

30

21,5

21,3

21,5

21,2

3,29 (d,
J =11,0Hz)

69,6 3,7 (1H, m) 69,1
78,2

65,9

4,2 (1H, m)
3,4 (d, J =
10,4Hz)

48,7

3,30 (d, J =
11,0Hz)
3,54 (d,
J=11,0Hz)


Header Page 18 of 126.

16

4.3. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT AMIT CỦA AXIT ASIATIC

Sau khi chiết tách và tinh chế ñược axit asiatic là có ñộ sạch > 98%,
tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic theo sơ ñồ 2.
4.3.1. Chất: 3, 23-O-isopropyliden asiatic acid (40)

Phổ 1H-NMR (Hình 4.2, 4.3 và 4.4) cho thấy có 6 nhóm metyl trong
ñó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại δH =
0,694 (3H, s, CH3); 0,806 (3H, s, CH3); 1,004 (3H, s, CH3); 1,033 (3H, s,

18

2-[(3-carboxypropanoyl)oxy]

3,23-O-isopropyliden

asiatic acid (41)

41
Khi cho chất (40) phản ứng với succinic anhydrit trong CH2Cl2 và
trietylamin, thu ñược hợp chất este (41).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (Hình 4.12 và 4.13) xuất hiện
hai tín hiệu ở δ (ppm) : 2,57- 2,71 (4H, m, 2 x CH2) của mạch nhánh ñược
gắn vào và tín hiệu H-2 dịch chuyển từ trường cao δH = 3,6 ppm về phía
trường thấp ở δH = 5,03 ppm.
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 41 cho tín hiệu của 37 nguyên
tử cacbon, trong ñó có 11 nguyên tử cacbon bậc 2, 10 cacbon bậc 4, 8
nguyên tử cacbon bậc 1 và 8 cacbon bậc 3 (xem hình 4.14 và 4.15). Đặc
biệt trên phổ 13C-NMR xuất hiện thêm 2 tín hiệu của nhóm CH2: δ/ppm =
23,7 ( C-2’); 23,1 (C-3’) , một nhóm este ở δ/ppm = 171,8 (C-1’) và một
nhóm cacboxylic tại δ/ppm = 178,0 (C-4’) xem (Hình 4.14 và 4.15).
Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ 13C-NMR và phổ DEPT như vậy nhóm
hydroxy ở vị trí C-2 tham gia phản ứng este với succinic anhydric ñể tạo
thành chất 41, phù hợp với cấu trúc trên.

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.



cacbon, trong ñó có 10 nguyên tử cacbon bậc 2, 8 cacbon bậc 4, 9 nguyên
tử cacbon bậc 1 và 8 cacbon bậc 3 (xem hình 4.19 và 4.20). Đặc biệt trên
phổ

13

C-NMR xuất hiện thêm 1 tín hiệu của nhóm CH3: δ/ppm = 21,2

(COCH3); 23,1 và một nhóm este ở δ/ppm = 173,1 ppm (OCOCH3); xem
(Hình 4.19 và 4.20).
Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ 13C-NMR và phổ DEPT như vậy nhóm
hydroxy ở vị trí C-2 tham gia phản ứng este với anhydric acetic ñể tạo
thành chất 42. Như vậy nhóm hydroxy ở vị trí C-3 ñã ñược acetyl hoá tạo
thành chất 42

Hình 4.16. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 42

Footer Page 22 of 126.


Header Page 23 of 126.

21

4.3.3. Chất: 2-acetyl-asiatic acid (43).

AcO

COOH

4.4.1. Thử hoạt tính gây ñộc tế bào
Bảng 4.5: Kết quả thử hoạt tính gây ñộc tế bào
STT
1
2
3
4
5

Tên chất

Ký hiệu mẫu

RM1(axit asiatic )
9
RM-12DMSBV
40
RMDV25mE
41
RM2AcV
42
RM2Ac
43
Chất tham khảo (Ellipticine)

KB
30,22
17,88
59,42
11,66

4.4.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh
Bảng 4.6. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh
Nồng ñộ ức chế 50% sự phát triểncủa vi sinh vật và nấm kiểm ñịnh IC50 (µg/ml)
Chất
Gram (+)

Gram (-)

Nấm

Staphylo
coccus
aureus

Bacillus
subtilis

Lactobacillus
Fermentum

Salmonella
enterica

Escheri
chia coli

Pseudomo
nas
aeruginosa



>128

>128

41

0,28

20,31

>128

>128

>128

>128

>128

42

1,41

20,7

>128

>128