i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH
TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC
KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

CHÍNH QUY

Chuyên ngành

:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH - CNTP

Lớp

Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện
đa khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi tận tình và đã cung
cấp cho tôi các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 28 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Tuấn Anh


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu ................................ 18
Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu ............................... 18
Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài nghiên cứu ................... 19
Bảng 4.1: Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .... 30
Bảng 4.2: Kiểu hình của 9 chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập được tại
Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ............................................... 33
Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 9 chủng Pseudomonas
aeruginosa ..................................................................................................... 38
Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gene kháng metallo β-lactamase với kiểu
hình kháng β-lactam của các chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập được
......................................................................................................................... 41


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH

vùng DNA đặc hiệu in vitro

RNA
ELISA

Ribonucleic Acid
Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Kỹ thuật
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme


v

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5
2.1. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) ................. 5
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) ..... 5
2.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 6
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................ 8
2.2.1. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới ....... 8
2.2.2. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước ......... 9
2.3. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn .......................................... 11
2.3.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh............................. 11
2.3.2. Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh .......................................... 11
2.3.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào ................. 12
2.3.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa ........... 13
2.4. Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc ...... 14

4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng
thuốc ................................................................................................................ 35
4.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 35
4.3.2. Kiểm định các chủng Pseudomonas aeruginosa .................................. 37
4.3.3. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa kháng thuốc .................................................................................. 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 44
5.1. Kết luận .................................................................................................... 44
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Chúng gây nên những
bệnh lí với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương,
nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong khá cao.
Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) đã
tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam. Cùng với sự
gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn khả năng kháng kháng sinh cũng tăng cao. Theo
báo cáo của CDC ước tính rằng mỗi năm ở Hoa Kì có hơn hai triệu người
mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì có ít nhất 23.000
người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa.
Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6000 (13%) là
đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Fatima A. và cs,
2012) [22]. Theo kết quả một nghiên cứu khác (2013), trong 112 mẫu P.
aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị bỏng tại một bệnh viện năm

nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các
dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu. Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR,
ELISA, DNA arrays…
PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ
trong một phép phân tích. Đây là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị
phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học
Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu


3
phƣơng pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas
aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam bằng kỹ thuật PCR”.
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ
kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa tại các bệnh nhân điều
trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014
đến tháng 5 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong
phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng các thuốc kháng sinh thuộc nhóm βlactam.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
- Mục tiêu của đề tài
Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ
xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.
- Yêu cầu của đề tài
+ Khảo sát được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương
Thái Nguyên.
+ Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc.
+ Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh
Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh
thường gặp ở Việt Nam thì P. aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các
vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% (Lê Đăng Hà và cs, 2003) [5].
Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y)
đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa đa giá, tinh chế và
đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân
bỏng (Lê Thu Hồng và cs, 2002) [7].
Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập
tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) của Hoàng Kim Tuyến và cộng
sự đã chứng minh được P. aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm
phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) (Hoàng Kim Tuyến
và cs, 2006) [13].


6
2.1.2. Đặc điểm sinh học
- Hình thái và cấu tạo
Trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng, hơi cong, hai đầu tròn, kích thước
0.5 - 1μm x 1 - 5 μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi
ngắn. Di động nhờ tiên mao đơn cực, ít khi có vỏ, không sinh bào tử (Balcht và
cs, 1994) [18].
- Cấu trúc tế bào
+ Vỏ Polysaccharide
Pseudomonas aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide
gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là
alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc
biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên
cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ.
+ Màng sinh chất:
Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein

hợp 37oC nhưng phát triển được ở nhiệt đố 5 - 42oC, pH thích hợp 7,2 - 7,5
nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 (Đái Duy Ban và cs, 2009) [1].
Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn,
dẹt, trung tâm hơi lồi (khuẩn lạc S). Một loại xù xì bờ không đều (khuẩn lạc
R), đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan
máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.
Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai.
Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên.


8
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới
Lateef A. (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu
bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa được tìm thấy
trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,
nước giếng và nước máy). Kết quả: 3,46% P. aeruginosa phân lập từ đất đề
kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng
sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng
sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin,
tetracycline, streptomycin, gentamicin). Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này
cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác
nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid,
ofloxacin, nitrofurantoin). Trong nước, 6,7% P. aeruginosa kháng lại 4 loại
kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin,
tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole) (Lateef A. và cs, 2005) [28].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng
đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa khá cao. Gales A. C. (1997-1999),
6631 chủng P. aeruginosa được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường
hô hấp tại 3 vùng khác nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin). Trong đó

uống chưa được nghiên cứu. Hầu hết khả năng gậy bệnh và tính đề kháng
kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm. Quá
trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng
sự trên các tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và
nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P. aeruginosa là nguyên nhân chính. Hơn thế
nữa, hầu hết 374 dòng trực trùng mủ xanh phân lập từ máu (16), nước tiểu
(47) và đờm (311) kháng nhiều loại kháng sinh. Ðối với cephalosporins thế hệ
3, đến 62,5% kháng cefotaxime và 38,9% kháng ceftazidime. Các vi khuẩn


10
này kháng amikacin 10,8% và tobramycin 59%. Trên fluoroquinolones, tỉ lệ
kháng ofloxacin là 58,3%, kháng norfloxacin 55,2% và kháng ciprofloxacin
43,8% (Võ Thị Chi Mai và cs, 1997) [11].
Nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại Bệnh viện Đa khoa
(BVĐK) tỉnh Quảng Ngãi và Bệnh viện Đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm
2003-2004 cho thấy P. aeruginosa đứng hàng thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, gặp chủ
yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon.
Kết quả kiểm tra mẫu nước y tế tại 2 bệnh viện cho thấy: năm 2003 mẫu nước
tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 các
mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm bé lấy từ sô đựng nước của
cả 2 bệnh viện (nước cất dùng làm ẩm bình ôxy, ngâm dây thở, hút đàm) đều
bị nhiễm P. aeruginosa và Pseudomonas sp. Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong
mẫu nước chủ yếu là P. aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram
âm (28,6%) (Hồ Việt Mỹ và cs, 2004) [12].
Trong một nghiên cứu của Lê Bảo Huy và cộng sự (2005), tác nhân gây
bệnh viêm phổi bệnh viện chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15% trong
đó P. aeruginosa chiếm 41,15%. Vi khuẩn này đã đề kháng cao đối với những
kháng sinh chuyên trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa
điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime

khuẩn. Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự
gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi
khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Kháng sinh nhóm
β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi
là penicillin binding protein (PBP) (Mulvey M. R. và cs, 2009) [32].


12
2.3.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong
trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng
trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid. Việc thâm nhập của
các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển
(porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác
động của nhóm kháng sinh này (Anton Y. P. và cs, 2010) [17].
Vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bao gồm màng bên trong và bên
ngoài, hoạt động như một rào cản chống thấm. Để vận chuyển các chất cần
thiết thông qua màng ngoài, các tế bào vi khuẩn sản xuất ra protein ngoài
màng (porins). Protein ngoài màng này cho phép khuếch tán các phân tử (bao
gồm cả thuốc kháng sinh vào trong tế bào. Các đột biến làm thay đổi cấu trúc
của protein ngoài màng tạo ra một rào cản làm cho các kháng sinh không thể
khuếch tán vào trong tế bào. Cơ chế này có ở P. aeruginosa và các trực khuẩn
Gram âm khác có thể kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam
(Livermore D. M. và cs, 2001) [29].
Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps): hệ thống bơm thoát dòng có tác
dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi
khuẩn. Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế
chính của vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline,
minocycline, doxycyc-line) mã hóa bởi gene Tet (Tet-pump). Hiện nay, cơ
chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh

PSE-3, PSE-4, PSE-5, CARB-3, và CARB-4. Các enzyme này bị ức chế bởi
clavulanate. Tuy nhiên, chúng thủy phân hiệu quả ticarcillin và chúng cung
cấp cho P. aeruginosa khả năng kháng với ticarcillin-clavulanate
Nhóm OXA-type Penicillinases: bị ức chế bởi clavulanate và tazobactam.
Có tác dụng thủy phân hiệu quả với loxacillin và oxacillin.
Nhóm OXA-type β-lactamase phổ rộng: có khả năng thủy phân
oxyimino-cephalosporin và aztreonam và tăng khả năng kháng thuốc cho P.
aeruginosa.
Nhóm OXA-type Carbapenemases: các OXA-type carbapenemases có ái
lực cao với carbapenems, chúng thủy phân không hiệu quả các chất và khó để
đánh giá ý nghĩa lâm sàng của chúng.


14
Nhóm Carbapenemases: Có khả năng thủy phân các penicillin, cephalosporin
và aztreonam nhưng chúng bị ức chế bởi tazobactam và clavulanic acid.
Nhóm Metallo β-lactamase: cung cấp sức đề kháng đối với penicillin, ức
chế sự kết hợp giữa penicillin và carbapenems.
2.3.4.2. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
Các OprD porin của P. aeruginosa là một porin chất nền cụ thể tạo điều
kiện cho sự khuếch tán các amino acid cơ bản các peptide nhỏ và
carbapenems vào trong tế bào. Khi các OprD giảm xuống hoặc bị mất đi tính
nhạy cảm của P. aeruginosa đối với carbapenems cũng giảm (Daniel J. W. và
cs, 2013) [21].
β-lactam tự do khuếch tán vào tế bào P. aeruginosa. Tuy nhiên enzyme βlactamase gặp phải trở ngại lớn trong quá trình xâm nhập vào trong tế bào P.
aeruginosa do sự bơm đẩy ra khỏi tế bào. Có 3 cơ chế bơm đẩy β-lactam cụ
thể là: MexAB-OprM, MexCD-OprJ và MexXY (Daniel J. W. và cs, 2013)
[21].
2.4. Các phƣơng pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
2.4.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch

- Ưu điểm: Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA nào đó sẽ được
tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR. Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp
trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gene đặc hiệu
cần khuếch đại trên thạch điện di. Kỹ thuật PCR hiện đang được sử dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực như Y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục
đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát
hiện các gene kháng kháng sinh (Kumarasamy K. K. và cs, 2010) [27].
- Hạn chế: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại.
Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại.


16
Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm
lớn (do thao tác nhiều lần).


17
Phần 3
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc phân lập từ
bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ tháng
12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Các chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc thu thập được từ người
bệnh điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ từ tháng 12
năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu

blaVIMF TGGTGTTTGGTCGCATATCG
blaVIMR GAGCAAGTCTAGACCGCCCG
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài

60
66
63
62
64
68

Kích thƣớc
sản phẩm
PCR (bp)
483
459
595

Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Fermentas, Đức
Fermentas, Đức
Fermentas, Đức