LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy và TS. Nguyễn Tuấn Anh với sự
cộng tác của các đồng nghiệp. Các số liệu và kết quả trong luận án này là hoàn toàn
trung thực và chƣa từng đƣợc tác giả khác công bố.
Tác giả luận án

Bùi Ngọc Tân

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận đƣợc rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều
lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thành Thị Thu
Thủy, TS. Nguyễn Tuấn Anh - ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án này, đã cho
tôi những lời khuyên bổ ích, những lời động viên trong những lúc tôi gặp khó khăn
và truyền cho tôi lòng say mê khoa học.
Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt
của các cô chú, các anh chị em tại:
- Trung tâm các phƣơng pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Bộ môn Hữu cơ - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội.
- Bộ môn Hóa học - trƣờng Đại học Y Dƣợc Hải Phòng.
- Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng công nghệ Nha Trang.
- Phòng Thử nghiệm Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 19
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................... 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 21
2.2.1. Phƣơng pháp chiết tách .......................................................................... 21
2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc .............................................................. 21
2.2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) .......................................... 21
2.2.2.2. Phƣơng pháp phổ IR ........................................................................... 22
2.2.2.3. Phƣơng pháp phổ NMR. ..................................................................... 23
2.2.2.4. Phƣơng pháp phổ MS ......................................................................... 26
2.2.2.5. Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) . 29
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học ...................................................... 32
2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................... 32
2.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa ..................................................................... 33
2.2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................................................ 35
2.2.3.4. Hoạt tính chống đông tụ máu .............................................................. 36
iii


2.2.3.5. Hoạt tính ly giải cục máu đông ........................................................... 36
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM................................................................................ 38
3.1. Thu hái, định danh và xử lý mẫu quả me ...................................................... 38
3.1.1. Thu hái và định danh ............................................................................. 38
3.1.2 Xử lý mẫu ............................................................................................... 38
3.2. Chiết tách và tinh chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) từ thịt và hạt me
.............................................................................................................................. 38
3.2.1. Xác định thành phần hóa học của thịt và hạt me ................................... 38
3.2.2. Chiết tách và tinh chế TSP từ thịt và hạt me ......................................... 40
3.3. Điều chế dẫn xuất .......................................................................................... 42
3.3.1. Sulfate hóa ............................................................................................. 42

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU.............................................. 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 106
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 120

v


DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh
Association of Official Analytical
Chemist
Arabinopyranose

Diễn giải

Carbon-13 nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
carbon 13

COSY

Correlation spectroscopy

Phổ COSY

CS%


Fucopyranose
Galactose
Galactopyranose
Glucose
Glucopyranose
Gel Permeation Chromatography
Proton nuclear magnetic resonance
spectroscopy
Human cervical cell cancer
Human hepatocellular carcinoma

AOAC
Arap
13

C-NMR

DEPT

1

H-NMR

HeLa
Hep-G2
HMBC
HPLC
HR-ESI-MS
HSQC

thử nghiệm


IR
KB

Infrared spectroscopy
Human epidemoid carcinoma

LD50

lethal dose 50%

LS
MCF7

Light Scattering
Michigan cancer foundation-7

Phổ hồng ngoại
Ung thƣ biểu mô ngƣời
Liều gây chết 50% động vật thực
nghiệm
Tán xạ ánh sáng
Ung thƣ vú ngƣời

MIC

Minimum inhibitory concentration


Acetyl Tamarind Seed Polysaccharide

TSP acetyl hóa

NOESY
OD
ROESY

TSPS
WHO
XyG
Xyl
Xylp

Sulfated Tamarind Seed
Polysaccharide
World Health Organization
Xyloglucan
Xylose
Xylosepyranose

vii

Mật độ quang học
Phổ ROESY
Tán xạ tia X góc nhỏ
% khả năng trung hòa gốc tự do
Hiển vi điện tử quét
Acid trichloracetic
Acid trifluoroacetic

Bảng 4.15. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ số mol tác nhân sulfate với DS
Bảng 4.16. Kết quả phân tích phổ IR của TSPS4
Bảng 4.17. Kết quả từ phép đo LS của TSP và TSPS4
Bảng 4.18. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ số mol acetyl với DA
Bảng 4.19. Kết quả phân tích phổ IR của TSPA4
Bảng 4.20. Giá trị IC50 hoạt tính gây độc tế bào (g/ml)
Bảng 4.21. Kết quả hoạt tính khử sắt và chống oxy hóa tổng số
Bảng 4.22. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
viii


Bảng 4.23. Kết quả hoạt tính chống đông tụ máu
Bảng 4.24. Kết quả hoạt tính ly giải cục máu đông

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP)
Hình 2.1. Quả của cây me (Tamarindus indica L.) thu hái tại huyện Thủy Nguyên,
Hải Phòng
Hình 2.2. Sơ đồ khối của thiết bị GPC
Hình 2.3. a) Phổ 1H-NMR của (13) và (14) -D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của
(13) và (14) -D-glucan
Hình 2.4. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong polysaccharide
Hình 2.5. Phổ khối của poysaccharide và dẫn xuất (anion, cation và benzyl amin) đo
bằng a) MALDI-ToF-MS và b) ESI–MS
Hình 2.6. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate
Hình 2.7. Sơ đồ tổng quát về phổ khối nhiều lần

b) Biểu đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.21. a) Mô hình cấu trúc phân tử của TSP xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học
(với n=4), b) Biểu đồ Kratky với các đƣờng tán xạ từ thực nghiệm (đƣờng đỏ)
và từ mô hình cấu trúc phân tử (đƣờng đen)
Hình 4.22. Cấu trúc hóa học của TSPchiết tách từ hạt me thu hái tại Hải Phòng
Hình 4.23. Phổ IR của a) TSP và b) TSPS4
Hình 4.24. Phổ 13C-NMR của a) TSP b) TSPS4
Hình 4.25. Ảnh SEM của a)TSP và b) TSPS4
Hình 4.26 Kết quả đo SAXS của TSPS4 0,5% trong nƣớc: a) Đƣờng tán xạ, b) Biểu
đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.27. Phổ IR của: a) TSP và b) TSPA4
Hình 4.28. Phổ 1H-NMR của: a) TSP và b) TSPA4
Hình 4.29. Ảnh SEM của a)TSP, b) TSPA4
Hình 4.30 Kết quả đo SAXS của TSPA4 0,5% trong nƣớc: a) Đƣờng tán xạ, b) Biểu
đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.31. Mối tƣơng quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa
tổng số với DS của TSPS
Hình 4.32. Mối tƣơng quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa
tổng số với DA của TSPA
Hình 4.33. Ảnh thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hình 4.34. Mối tƣơng quan giữa khả năng ly giải cục máu đông với DS của TSPS
xi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nƣớc ta có thảm thực vật phong phú và đa dạng, có truyền thống về sử dụng
các loài thực vật làm thuốc chữa bệnh. Theo các số liệu thống kê mới nhất, Việt
Nam có trên 12000 loài thực vật, trong đó hơn 3200 loài đƣợc sử dụng làm thuốc
trong y học dân gian.
Những hợp chất tự nhiên phân lập từ thực vật đƣợc ứng dụng trong rất nhiều

3


3,6-Anhydro-α-L-Gal

Aga

3,6-Anhydro-α-D-Gal

Carrageenan

α-L-Fucp

Xyloglucan, Pectin

β-D-Fruf

Xyloglucan

α-D-GalpA

Pectin

β-D-Manp

Galactomannan;
glucomannan; xanthan

β-D-ManpA


nhánh là -D-GalpA-(1,2)--D-Xylp (Y) và -L-Fucp-(1,2)--D-GalpA-(1,2)--DXylp (Z). Một mô tả khác của mạch nhánh gồm -L-Araf-(1,2)--D-Xylp (S) và L-Araf-(1,3)--L-Araf-(1,2)--D-Xylp (T) có trong nhiều loài khác nhau. Với mạch
nhánh A, B, C đƣợc tìm thấy trong tế bào của nhiều loài cây với mạch chính là
glucose bao gồm cả hai liên kết tại vị trí O-6 và O-2. Mạch nhánh (M, N, P, Q)
đƣợc tìm thấy trong những thực vật vô mạch nhƣ loài Physcomitrella patens trong
khi U đƣợc tìm thấy trong hạt cây argan và cây Việt quất.
5


Hình 1.1. Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan

Xyloglucan đầu tiên đƣợc phát hiện trong hạt của cây Tòng chi (Hymenaea
courbaril). Cấu trúc hóa học của xyloglucan đã đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp
phân tích methyl hóa. Cấu trúc này cũng có trong hạt sen cạn, hạt lanh… và có cấu

6


trúc oligosaccharide là XXXXG. Nghiên cứu khác cho thấy XyG từ hạt của loài
Tòng chi có cấu trúc và tính chất nhƣ xyloglucan đƣợc tổng hợp từ hạt me.
Từ rất nhiều các nghiên cứu ngƣời ta đã tìm ra các đặc trƣng của xyloglucan
nhƣ: có bốn gốc đƣờng trong cấu trúc của TSP có trong hạt me đã đƣợc xác định
theo William và cộng sự khi sử dụng tia X tại bƣớc sóng 2,06 nm [111].
Burchard và cộng sự [21] bằng phƣơng pháp tán xạ ánh sáng đa góc
(Multiangle laser light scattering -MALLS) đã cho thấy polysaccharide thuộc lớp
chất xyloglucan có trọng lƣợng phân tử của khoảng 8.8x105g. mol-1. Các tác giả đã
sử dụng phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động và tĩnh để nghiên cứu cấu trúc chuỗi và
các tƣơng tác trong phân tử, nghiên cứu chỉ ra rằng các chuỗi đơn có dạng bó xoắn
là nguyên nhân tạo nên độ cứng của hạt.
Hiện nay, ngƣời ta đã đƣa ra cấu trúc chính xác của dẫn xuất oligosaccharide
từ xyloglucan chiết tách từ các hoại hạt H. courbariland và T. indica thu thập tại

càng khan hiếm [31].
Đặt biệt là quả me và hạt me đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần
và tác dụng trong hóa học thực vật và dƣợc phẩm. Trong quả me có chứa chủ yếu
hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali
bitactrat 3,25%, đƣờng 12,5%, gôm 4,70%, pectin 6,25%. Ngoài ra còn có 34,35%
xơ, nƣớc 27,55%. Trong hạt có glucozan, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ.
Trong đời sống quả me đƣợc sử dụng theo mùa vụ, nhƣ làm thực phẩm, tạo hƣơng
vị, gia vị trong món cà ri, súp và cũng là thành phần chính trong một số loại nƣớc
ép và đồ uống [98]. Ngƣời ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào
trong đồ uống, dịch chuyền và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo. Nƣớc quả me là
loại đồ uống bổ dƣỡng đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức
chế biến khác nhau. Tại một số quốc gia châu Phi nƣớc quả me đƣợc trộn với tro gỗ
để trung hòa vị chua của acid tartaric. Tuy nhiên phƣơng pháp phổ biến nhất là
thêm đƣờng để tạo vị ngọt cho đồ uống. Phần lớn sản phẩm đồ uống có nƣớc me
đƣợc sản xuất thƣơng mại. Đôi khi nƣớc quả me đƣợc cho vào trong đồ uống có cồn
[3,31].
Trong y học, theo đông y [3, 6, 7, 10], quả me có vị chua, tính mát, có tác
dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát,
có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa
(kiết lỵ, ỉa chảy..) và nấu nƣớc để ngậm chữa viêm lợi.

8


Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thƣờng đƣợc dùng để nấu
nƣớc tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè. Thịt me, lá và hoa đƣợc
kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau.
Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng nhƣ: Quả
me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị
nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có

Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và
đƣợc đƣa vào sử dụng trong cuộc sống. Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm
năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá
trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dƣỡng và dƣợc phẩm.
1.2.2. Cấu trúc hóa học và ứng dụng của polysaccharide từ quả me
Theo Patel và cộng sự [77], polysaccharide phân lập đƣợc từ quả me thuộc lớp
chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí C6 là liên
kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(1-2)--Dxylopyranose. Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG, bao gồm ba
nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và đƣợc phân cách bằng một
glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose đƣợc liên kết với
galactopyranose (L) theo Hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP)

Gần đây cấu trúc của TSP đƣợc mô tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo
kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), và monosaccharide
(Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã đƣợc đề cập.

10


Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào
trọng lƣợng phân tử, một số polysaccharide có trọng lƣợng phân tử nhỏ đều có các
hoạt tính sinh học quý giá và đƣợc sử dụng trong y học. [12,13].
Trong hạt me có các chất tanin và chất nhuộm màu ở vỏ ngoài của hạt, do vậy
hạt me không thể dùng trực tiếp đƣợc. TSP là thành phần có trong bột hạt me (TKP)
đóng vai trò quan trọng khi đƣợc sử dụng trong ngành may mặc, giấy, sơ sợi hoặc
làm nguyên liệu thô để sản xuất polysaccharide dùng cho thực phẩm [40].
TSP chiết trong nƣớc có dạng gel và kết tủa trong dung môi hữu cơ, TSP có
trọng lƣợng phân tử từ 700–2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me

chính trong thuốc kháng sinh ƣa nƣớc và kị nƣớc. Tamarind seed polysaccharide kết
hợp với pectin có lƣợng methoxyl cao (6,8-8,4%) có khả năng thúc đẩy sự phát
triển gel và ổn định nhiệt [44,78,92].
Một số kết quả nghiên cứu TSP và sản phẩm biến tính của TSP đã thể hiện tốt
khả năng làm chất mang cho thuốc và kiểm soát liều lƣợng nhả thuốc với thuốc sử
dụng qua đƣờng uống [82].

1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc liên quan đến nội
dung nghiên cứu của luận án
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Việc nghiên cứu cấu trúc của các TSP và ứng dụng của nó đã đƣợc các nhà
khoa học trên thể giới nghiên cứu từ rất lâu. Các nghiên cứu này tập trung theo
hƣớng chiết tách TSP từ quả me và xác định cấu trúc của nó bằng nhiều phƣơng
pháp khác nhau. Các nghiên cứu về mặt ứng dụng của TSP cho thấy nó có khả năng
ứng dụng đa dạng trong rất nhiều lĩnh vực.
Michael và cộng sự [64] đã nghiên cứu cấu trúc và tính chất của TSP từ hạt
me. Kết quả cho thấy thành phần chính của polysaccharide trong quả me là một
galactoxyloglucan tỷ lệ galactose: xylose: glucose là 1:2,25:2,8. Một lƣợng nhỏ
polysaccharide (2-3%) có chứa phân nhánh (1→ 5)-α-L-arabinofuranan và không
nhánh (1→ 4)-β-D-galactopyranan, và xác định đƣợc cấu trúc dạng sợi bằng tia X.
Cấu trúc dạng chuỗi đƣợc rút ra từ nghiên cứu tán xạ ánh sáng tĩnh.
Để xác định nhóm phân tử đặc trƣng polysaccharide, Kacura Kova và cộng
sự [51] đã sử dụng phổ hồng ngoại của hỗn hợp nhiều loại polysaccharide dựa trên
thành phần đƣờng chủ yếu là các monosaccharide đã đƣợc nhận diện. Phổ FT-IR tại
vùng 1200–800 cm-1 cho biết thông tin về polysaccharide có trong mẫu đo. Phổ IR
12


polysaccharide có thể xác định đƣợc thành phần mạch chính nhƣng cũng chịu ảnh
hƣởng mạnh của mạch nhánh. Thông thƣờng mỗi mạch nhánh đều là đặc trƣng của



hóa học rất đa dạng nhƣng pectin polysaccharide và hemicellulose đã đƣợc xác định
bằng phổ FT-IR .
Một nghiên cứu khác của Vandana và cộng sự [109] đã tạo TSP dạng sợi có
cấu trúc nano để loại bỏ Hg(II), kết quả cho thấy khi kết hợp TSP với silica tạo dạng
sợi có cấu trúc nano có khả năng loại bỏ Hg(II) từ dung dịch. Sợi nano tổng hợp
đƣợc xác định cấu trúc bằng quang phổ hồng ngoại (FTIR), X-ray, nhiễu xạ tia X
(XRD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phân tích nhiệt trọng lƣợng, phân tích
nhiệt vi sai và phân tích quang.
Rupali Singh và cộng sự [85] đã chiết tách TSP bằng cách ngâm hạt me (đã
tách bỏ phần vỏ ngoài) trong nƣớc (trong 24h) và dịch chiết đƣợc lọc qua vải. Phần
không tan đƣợc loại bỏ và thêm một lƣợng tƣơng đƣơng ethanol để kết tủa dịch keo
chiết và đƣợc lọc. Phần không tan đƣợc ngâm chiết với nƣớc nhiều lần, cho đến khi
thu đƣợc hết dịch keo. Phần tủa của dịch keo đƣợc sấy bằng khí khô ở 40ºC đến
khối lƣợng không đổi thu đƣợc TSP chiếm 18,39% (theo khối lƣợng). Tác giả đã
tiến hành xác định lƣợng carbohydrate, protein, và các thành phần khác nhƣ
alkaloid, chất béo, amino acid, tannin và xác định màu sắc, mùi, vị, cấu trúc bề mặt.
Tác giả đã xác định khả năng tan trong một số dung môi khác nhau, xác định pH
của dung dịch 1%, đồng thời xác định khả năng trƣơng nở của TSP, xác định tỉ
trọng của bột TSP, khả năng tạo gel và độ nhớt của dung dịch TSP. Tác giả tiến
hành phân tích các tính chất của TSP thu đƣơc theo hƣớng ứng dụng trong y học.
Kết quả chỉ ra rằng TSP chiết tách từ hạt me đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân làm
đông trong y học và thực phẩm.
Năm 2010 Mishra và cộng sự [66] cũng đã khẳng định TSP hiện nay đang
đƣợc nghiên cứu nhƣ là một chất mang trong quá trình sử dụng thuốc. Dung dịch
TSP sử dụng làm chất mang của thuốc chữa bệnh đại tràng đã đƣợc dùng trong y
học. Cùng với tác giả Rashmirekha và cộng sự [83] đã nghiên cứu khả năng kiểm
soát liều lƣợng trong thuốc chống ung thƣ bằng sự kết hợp giữa Paclitaxel và
Tamarind Seed Polysaccharide. Với dung dịch TSP có các nồng độ (0,5 %, 1 %,