ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI – 2014
ĐẶNG NGỌC BÁCH
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình hướng
dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đặc biệt là tập
thể cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa hoc - Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại
trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học
tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận
được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học vi
ên Đặng Ngọc Bách

Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học vi
ên Đặng Ngọc Bách MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai 3
1.1.1. Động vật học 3
1.1.2. Phân bố sinh thái 3
1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm 4
1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai 5
1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu 12
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 13
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ
1 CC Column Chromatography
2 COSY Correlation Spectroscopy
3 DEPT Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
4 SKLM Sắc kí lớp mỏng
5 TLC Thin Layer Chromatography
6 NMR Nuclear Magnetic Resonance
7
13
C-NMR Cacbon-13-Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
8
1
H-NMR

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

9
1
H-
1
H COSY


Hình 3.1.a. Phổ
1
H-NMR của
DS1
20
Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của
DS1
20
Hình 3.1.c. Phổ
13
C-NMR của
DS1
21
Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1 21
Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1
22
Hình 3.1.e. Phổ HMBC của
DS1
23
Hình 3.1.f. Phổ COSY của
DS1
24
Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC (

) chính của DS1
24
Hình 3.2.a. Phổ
1
H-NMR của
DS2

13
C-NMR của DS3 30
Hình 3.3.d. Phổ HMQC của
DS3
30
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của
DS3
31
Hình 3.3.e. Phổ HMBC của
DS3
32
Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của
DS3
32 Hình 3.4.a. Phổ
1
H-NMR của DS4 33
Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của
DS4
33
Hình 3.4.c. Phổ
13
C-NMR của
DS4
34
Hình 3.4.d. Phổ HMQC của
DS4
34

Hình 3.6.a. Phổ
1
H-NMR của
DS6
41
Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của
DS6
41
Hình 3.6.c. Phổ
13
C-NMR của
DS6
42
Hình 3.6.d. Phổ HMQC của
DS6
42
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của
DS6
43
Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6 44
Hình 3.6.f. Các tương tác HMBC chính của
DS6
44
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 46
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 1 Hóa hữu cơ

LỜI MỞ ĐẦU
Diện

học và thực tiễn góp phần khai thác và bảo tồn một cách có hợp lý nguồn tài nguyên
cầu gai phong phú của đất nước.
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 2 Hóa hữu cơ

Trên cơ sở đó, luận văn tốt nghiệp này tập trung vào: “Nghiên cứu thành
phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm
sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử
dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn nguồn nguyên liệu biển quý giá của đất nước.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số hợp chất từ loài cầu gai Diadema savignyi
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được. Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 3 Hóa hữu cơ


loài; Tại vùng biển Vịnh Phong Vân – Bến Gỏi, Vĩnh Thái Lan, Phú Yên,
Khánh Hòa, Phan Thiết, thường xuất hiện nhiều loài có giá trị kinh tế cao.
- Thế giới: Loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vùng
biển Bắc Đại Tây Dương từ eo biển Anh Quốc sang New Jersey (Hoa Kỳ).
1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm [7]
+ Vùng biển Ðịa Trung Hải: Tại Ðịa Trung Hải, cầu gai ăn được nổi tiếng nhất là
Paracentrotus lividus. Loài này được xem là một món ăn ngon đặc biệt, bán tại các
nhà hàng ở các thành phố ven biển nơi chúng bị đánh bắt; Chúng có thể đến tận
vùng biển phía Nam Ái Nhĩ Lan, đường kính có thể đến 8 cm. Vỏ ngoài thường
được bán để làm quà lưu niệm.
+ Vùng Bắc Ðại Tây Dương: Tại vùng biển Bắc Ðại Tây Dương, từ eo biển Anh
quốc (English Channel) sang đến New Jersey (Mỹ), loài thường gặp nhất là
Strongylocentrus droebachiensis. Tuy nhiên chúng không được nhiều nơi ưa thích.
Loài này xuất hiện rất nhiều tại vùng biển Maine (Mỹ). Thị trường tiêu thụ của loài
động vật da gai này tương đối giới hạn chỉ tại một vài chợ buôn bán hải sản quanh
New York như Fulton Fish Market. Việc chuyên chở cũng khiến cho thị trường
không phát triển.

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis (nguồn www.wallawalla.edu)
Xa hơn về phía Nam Ðại Tây Dương, có nhiều loại cầu gai nhỏ hơn, ít ăn
được trừ loài Cidaris tribuloides trong vùng West Indies.
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 5 Hóa hữu cơ

+ Vùng Á Châu, Ðông Nam Á: Tại Ðông Nam Á, đa số cầu gai chỉ to bằng cỡ quả
táo tây, loài Diadema setosum tuy rất dồi dào nhưng cũng chỉ được tiêu thụ tại một
số địa phương (ngay tại Thái Lan loài này chỉ được dân tại đảo Kor Samuy ăn), có
lẽ do ở con vật có nhiều gai dài (có thể đến 20 cm) và nhọn đâm thấu qua da. Gai rất

chiết metanol của loài cầu gai D. setosum thu thập tại Hạ Long, Việt Nam. Kết quả
đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào mạnh trên 3 dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm là KB (human
epidermoid carcinoma - biểu mô), FL (fibrillary sarcoma of the uterus - màng tử
cung) và Hep-2 (Hepatocellular carcinoma - gan) với giá trị IC
50
lần lượt là 2,0,
3,93 và 2,4 g/ml [9].

5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1)
Đến năm 2008, nhóm nghiên cứu của các tác giả Nhật Bản tiếp tục công bố
một dẫn xuất gangliosit mới là 1-O-[9-O-metyl-(N-axetyl-α-D-neuraminozyl)-
(2
→6)
-β-D-glucopiranozyl]-ceramit (DSG-A, 2), cùng với bốn gangliosit đã biết.
Các hợp chất này thể hiện hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenic
activity) trên dòng tế bào thần kinh nội tiết ở tủy tuyến thượng thận của chuột PC-
12 (rat pheochromocytoma cell line) với sự có mặt của nhân tố phát triển dây thần
kinh (nerve growth factor). Một điều đáng quan tâm là hợp chất 2 có nhóm metoxi ở
đơn vị đường NeuAc thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Điều này cho thấy, nhánh axit
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 7 Hóa hữu cơ

sialic bị O-metyl hóa đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính tạo tế bào thần kinh
hình sợi của các hợp chất gangliosit phân lập được từ các loài da gai [10].

DSG-A (2)
Gần đây nhất, sự có mặt của các hợp chất sắc tố dạng napthoquinon trong các
loài cầu gai Tripneustes gratilla, Diadema setosum và Paracentrous lividus cũng

quan tâm khoa học quan trọng mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng
dược học.
Nhóm chất steroit được tìm thấy ở hầu hết các mẫu nghiên cứu thuộc ba
nhóm hải miên, san hô mềm và da gai ở Việt Nam. Hợp chất có hàm lượng cao và
xuất hiện trong hầu hết các loài sinh vật biển thu thập được là cholesterol. Hợp chất
này được phân lập từ loài san hô mềm Cladiella sp. sao biển Archaster tyicus, hải
miên Xestospongia testudinaria và Gellius varius. Ngoài ra, các dẫn xuất của cholesterol như 7α-hiđroxi-cholesterol, 7β-
hiđroxi-cholesterol và dẫn xuất mới 7α-metoxi-cholesterol được phân lập từ loài
rong sụn Kappaphycus alvarezii. Nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên
Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm chất steroit như các hợp chất
ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol. Hợp chất này cũng
được phân lập từ loài hải miên Varius, X. testudinaria và cầu gai Diadema setosum.
Nghiên cứu thành phần hóa học của loài hải miên Haliclona clathrata đã
phân lập được hợp chất mới là 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol cùng với (24R)-
24-etylcholest-4-en-3,6-đion, (24R)-24-etylcholest-3,6-đion. Ngoài ra, các hợp chất
cholesterol
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 9 Hóa hữu cơ

cholest-7-en-3β,5α,6β-triol và 6β-metoxicholest-7-en-3β,5α-điol cũng được phân
lập từ loài hải miên G. varius. Saringosterol, cholest-7-en-3-on cũng được xác định
từ loài hải miên X. testudinaria. Một điều đáng quan tâm là hợp chất saringosterol
được các nhà khoa học trên thế giới công bố có hoạt tính kháng vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis rất mạnh với giá trị nộng độ tối thiểu (MIC-Minimum
inhibitory concentration) là 0,25µg/ml và đây là giá trị MIC nhỏ nhất trong các hợp
chất thiên nhiên được chiết tách tính đến năm 2001. Giá trị này tương đương với giá


Gần đây, một số steroit mới là lobophytosterol cùng với (22S,24S)-24-metyl-
22,25-epoxifurost-5-en-3β,20β-điol, (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol, pregnenolon
cũng đã được phân lập từ san hô mềm Lobophytum laevigatum. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng hợp chất lobophytosterol thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dòng tế bào
ung thư được thử nghiệm là phổi, ruột và máu.
cladiasterol

sarcomilasterol

3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11-
-secocholestan-5-en-9-on
(24S)-ergostan-
-3β,5α,6β,25-tetraol

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 11 Hóa hữu cơ

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần steroit của các loài da gai cũng
thu được một số kết quả đáng quan tâm. Các hợp chất steroit mang nhiều nhóm

- Tên khoa học: Diadema savignyi
(Diadematidae).
- Thời gian thu mẫu: 12/2011.
- Địa điểm thu mẫu: Nha Trang.
- Người giám định loài: ThS. Nguyễn Thị
Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang.

Mô tả, nhận dạng
Màu sắc của con trưởng thành thường đen, kể cả toàn bộ chóp nón hậu môn.
Khi sống, trong ánh sáng ban ngày, các đốm mắt tạo thành một vòng xanh quanh hệ
thống đỉnh. Cũng có những đốm trắng xuất hiện trên mặt lưng trong mỗi đường xen
tia, mặc dù không rõ ràng. Những con non gai tay có băng ngang, ngay cả khi
đường kính ngang của vỏ đến 30 mm, điều này trái với màu đen của các gai ở D.
setosum.
Mỗi mảnh xương ở vùng chân ống mang 3 đôi lỗ, vùng lỗ ở gần miệng trụi
gai và rộng ra, có 2 hàng nấm gai nguyên thủy. Mỗi vùng trung gian có 2 hàng nấm
gai nguyên thủy, thường có 4-5 nấm gai trong mỗi hàng ngang. Vỏ trụi gai còn cho
thấy các đường sọc xanh ở giữa các mảnh gián tiếp.
Kích thước: đường kính ngang thường gặp của vỏ ở con trưởng thành từ 40-65 mm
(có khi đạt tới 100 mm), chiều cao từ 20-40 mm.
Loài này rất giống D. setosum, nhưng có thể phân biệt được nhờ màu sắc hậu
môn. Trên hậu môn D. setosum có 1 vòng màu cam, trong khi hậu môn D. savignyi
hoàn toàn đen.
Sinh học -Sinh thái học
Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 13 Hóa hữu cơ

Diadema savignyi sống ở các vùng nước nông. Sống trong rạn san hô, từ

10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định
vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc kí cột (CC)
Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo.
Silica gel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica
gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50m, Fujisilisa Chemical Ltd.).
2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR):
1
H-NMR (600 MHz),
13
C-NMR (150
MHz), HMQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer
của Viện Nghiên cứu khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại
và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp chất, kể cả
cấu trúc lập thể của phân tử.
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 14 Hóa hữu cơ

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ
1
H và
13
C dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa vào

1
H COSY (Homocosy), (
1
H-
1
H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với
nhau.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu
diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này
mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định theo phương
pháp MTT (3-[4,5-đimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom) [12]. Ba dòng tế
Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 15 Hóa hữu cơ

bào ung thư người dự kiến sẽ sử dụng là HL-60 (human acute promyeloid leukemia
- ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5
(human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi trường RPMI
1640 bổ sung 10% huyết thanh phổi bò (fetal bovine serum) và
penicillin/streptomycin (tương ứng 100 U/mL và 100 mg/mL) ở 37 °C trong môi
trường 5 % CO
2
được làm ẩm. Các tế bào phát triển theo cấp số nhân được sử dụng
trong các thí nghiệm.
Phương pháp MTT được tiến hành như sau: Các dòng tế bào ung thư người
(HL-60; 3 × 10

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 16 Hóa hữu cơ

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng
a. Quy trình xử lý mẫu
Mẫu sinh vật biển sau khi thu về được tiến hành bảo quản theo quy trình
thống nhất sau:
- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại muối và tạp bẩn.
- Để ráo nước ở nhiệt độ phòng, ép nhẹ bằng giấy lọc bản để thấm hết nước.
- Cho từng mẫu vào các túi ni lông sạch, kèm theo ký hiệu mẫu được ghi
bằng bút chì trên giấy nến để tránh bị mờ hoặc rách nát khi tiếp xúc với nước và ở
điều kiện lạnh âm sâu.
- Lập danh sách mẫu sinh vật biển với ký hiệu mẫu.
Các túi mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh âm sâu (Frigor 3000 l, ở -20
o
C) để
đảm bảo mẫu không bị phân hủy bởi vi sinh vật.
b. Quy trình tạo dịch chiết
Các mẫu sinh vật biển được chiết theo quy trình sau:
Bước 1: Lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh: Trong quá trình lấy mẫu phải rất thận trọng
vì trong tủ lạnh âm sâu do có sự tạo tuyết nên các túi mẫu sẽ bị dính vào nhau do đó
rất dễ bị rách khi lấy mẫu ra. Nếu túi bị rách sẽ có thể làm mất kí hiệu mẫu gây ra
sự cố không xác định được mẫu hoặc nhầm lẫn giữa các mẫu với nhau.
Bước 2: Mẫu lấy ra được để giải đông ở nhiệt độ phòng sau đó rửa lại nhiều