BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

ĐỖ HOÀNG HẢI

NGHIÊN CỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG
CỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT
VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ (ANGELICA
DAHURICA (FISCH. EX HOFFM.) BENTH.ET HOOK. F.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn


HÀ NỘI – 2015
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

ĐỖ HOÀNG HẢI

NGHIÊN CỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên
cứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Mai Hương và tập thể cán
bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các Hợp chất
thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,
những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để
tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi
dào sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn

Đỗ Hoàng Hải
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận
văn này là hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị
nào. Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các
thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./.
Tác giả luận văn


1.4.5. Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng ....................................12
1.5. Những nghiên cứu và ứng dụng của khu hệ nấm cộng sinh trong đất
và rễ ............................................................................................................13
1.5.1. Trên thế giới ..................................................................................13
1.5.2. Ở Việt Nam ....................................................................................14
1.6. Tình hình phát triển cây dược liệu ở Việt Nam [1] .............................16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

iii


1.7. Cây bạch chỉ (Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth.et Hook.
f.).................................................................................................................18
1.7.1. Tên khoa học .................................................................................18
1.7.2. Nguồn gốc, phân bố ......................................................................18
1.7.3. Đặc điểm sinh học, sinh thái .........................................................19
1.7.4. Sản lượng cây ................................................................................19
1.7.5. Hoạt tính sinh học (Tác dụng dược lý) .........................................19
1.7.6. Thành phần hóa học ......................................................................21
1.7.7. Hoạt chất imperatorin ...................................................................22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................24
2.1. Vật liệu ................................................................................................24
2.1.1. Đất và rễ cây Bạch chỉ ..................................................................24
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm .....................................................24
2.1.2.1. Hóa chất...................................................................................24
2.1.2.2. Thiết bị phòng thí nghiệm .......................................................24
2.1.3. Môi Trường ...................................................................................25
2.1.3.1. Môi trường phân lập nấm vùng rễ...........................................25

chủng nấm lựa chọn .............................................................................30
2.2.4.3. Xác định khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp của các chủng
nấm lựa chọn ........................................................................................30
2.2.5. Tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm. .....................................31
2.2.5.1. Lên men các chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật ...31
2.2.5.2. Quy trình phối trộn tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm .32
2.2.6. Thử nghiệm chế phẩm trên cây bạch chỉ .....................................32
2.2.6.1. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ
..............................................................................................................32
2.2.6.2. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến hàm lượng chất
imperatorin của rễ củ cây bạch chỉ sau khi thu hoạch .........................35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................38
3.1. Phân lập các chủng nấm ......................................................................38
3.2. Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử
nghiệm ........................................................................................................38
3.2.1. Khả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng nấm phân lập .38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

v


3.2.2. Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm
lựa chọn ...................................................................................................39
3.2.3. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA) của
các chủng nấm lựa chọn.........................................................................40
3.2.4. Xác định khả năng đối kháng của các chủng nấm lựa chọn.........42
3.3. Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử ...............................42
3.4. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm lựa chọn để tạo

Viết tắt

Viết đầy đủ

1

Al

Nhôm

2

AM

Arbuscular mycorrhiza

3

CFU

Colony forming unit

4

ECM

Ectomycorrhiza

5


STT

Số thứ tự

11

VA

Vesicular arbuscular

12

VAM

Vesicular arbuscular mycorrhiza

13

VM

Vesicular mycorrhiza

14

VSV

Vi sinh vật

15


.......................................................................................................................40
Bảng 3.3: Khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng nấm lựa chọn .........41
Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp IAA thô và phân giải phốt phát khó tan của
các chủng nấm lựa chọn ................................................................................41
Bảng 3.4: Kết quả đối kháng của các chủng nấm lựa chọn..........................42
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường lên men đến sự sinh trưởng và phát triển
của các chủng nấm lựa chọn ..........................................................................45
Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường lên men .........................................45
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến sự sinh trưởng và phát
triển của các chủng nấm lựa chọn .................................................................46
Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của pH môi trường lên men ...................................47
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự sinh trưởng và phát triển
của các chủng nấm lựa chọn ..........................................................................47
Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của thời gian lên men .............................................48
Bảng 3.8: Giai đoạn phát tiển của cây bạch chỉ ............................................49
Biểu đồ 3.4: Động thái tăng trưởng chiều cao ...............................................50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

ix


Biểu đồ 3.5: Động thái tăng trưởng số lá ......................................................50
Biểu đồ 3.6: Động thái tăng trưởng về đường kính tán .................................51
Biểu đồ 3.7: Động thái tăng trưởng chiều dài rễ củ ......................................52
Biểu đồ 3.8: Động thái tăng trưởng đường kính rễ củ...................................52
Bảng 3.9: Đánh giá năng suất rễ củ bạch chỉ ................................................54
Bảng 3.10: Kết quả xác đinh hàm lượng imperatorin trong cao chiết MeOH
mẫu BC1 ........................................................................................................55

thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong
đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh
một số dịch hại không dự báo trước. Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền
nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng phân bón hữu cơ, chế phẩm
sinh học đặc biệt là chế phẩm nấm rễ trong canh tác nhằm nâng cao năng suất,
chất lượng cây trồng, duy trì và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là
vấn đề cấp bách cần được quan tâm hiện nay.
Bên cạnh các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các cây nông, lâm
nghiệp thì việc nghiên cứu tăng năng suất, chất lượng thảo dược cũng như
nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển những loài thảo dược quí có tiềm
1


MỞ ĐẦU

năng là vấn đề cần được quan tâm đặc biệt. Thảo dược thường có mặt ở nhiều
nơi trên thế giới, đặc biệt là các khu vực nhiệt đới. Thảo dược hiện đang đóng
vai trò quan trọng trong các liệu pháp chữa bệnh bằng y học cổ truyền tại các
nước phương Đông. Thảo dược không những mang đến các nguồn lợi về dược
học cho cộng đồng dân cư sinh sống tại những nơi đó mà còn đóng góp vào
các liệu pháp chữa bệnh cho cộng đồng ở những khu vực khác. Việt Nam nổi
tiếng với nguồn thảo dược phong phú, tuy nhiên việc nghiên cứu tăng sản
lượng cũng như chất lượng của thảo dược, đặc biệt là từ các chế phẩm nấm rễ
chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm rễ
trên cây thảo dược là một hướng đi mới mẻ và vô cùng cấp thiết. Xuất phát từ
những lý do và yêu cầu thực tiễn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu khu hệ nấm rễ và đánh giá tác động của việc sử dụng chế phẩm nấm
rễ lên năng suất và chất lượng của cây thuốc bạch chỉ (Angelica dahurica
(Fisch. ex Hoffm.) Benth.et Hook. f.).”.
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định được tác động của chế phẩm nấm rễ

dinh dưỡng còn thực vật nhận được từ khu hệ nấm các chất dinh dưỡng khác
và nước. Không phải tất cả các loài trong khu hệ nấm trong đất đều cộng sinh
với tất cả nấm trong các loại nấm của rễ cây mà có loài trong khu hệ nấm ở rễ
sẽ cộng sinh được với cây này nhưng loại này chưa chắc đã cộng sinh với các
loài cây khác. Ví dụ: Nấm vòng mật (Armillariella) và nấm sợi hạch
(Rhizoctonia) cộng sinh với các cây họ Lan nhưng lại gây bệnh với cây gỗ.
Cho nên các tác giả cho rằng hiện tượng cộng sinh của nấm rễ là một trạng
thái cân bằng giữa một kẻ “tấn công” và một bên “phòng thủ”. Người ta dự
đoán trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm rễ. Theo thống
kê của Trappe (1962) có 535 loài nấm thuộc 81 chi, 3 họ, 10 bộ nấm có thể
cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau. [38]
Nấm rễ - Mycorrhiza là nấm cộng sinh với rễ cây. Thuật ngữ này được
Frank sử dụng đầu tiên năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và
3


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

rễ cây thông cũng như đối với một số cây lá rộng khác. Bắt nguồn từ chữ Hy
Lạp “Mykes” có nghĩa là nấm và “Rhiza” có nghĩa là rễ, tạo thành Mycorrhiza
(nấm rễ) [15]. Nấm nội sinh ở rễ cây nên được gọi là nấm rễ, cây mang nấm
được gọi là rễ - nấm. Rễ cây có nấm cộng sinh đã được phát hiện trong các
cây hóa thạch họ Quyết có độ tuổi khoảng 400 triệu năm. [15,16,17]
Các loài nấm cộng sinh trong khu hệ nấm phần lớn thuộc bộ nấm Tán,
nấm tán đỏ, nấm gan bò, nấm mỡ, nấm bụng, nấm cổ ngựa.
1.2. Phân loại khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ
Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại:
nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.

loài, danh sách các loài, chi, họ, nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể
quả trên mặt đất như nấm gan bò (Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm
tán đỏ (Russula), nấm da (Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma),
nấm cổ ngựa đậu màu (Poisolithus)… [12]
Trong các loài cây có hoa gồm cả cây gỗ và cây bụi thì có tới 3% trong
số đó có khu hệ nấm vùng rễ, hầu hết là nấm ngoại cộng sinh, trong đó có các
cây như họ Long não (Lauraceae).
Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh:
Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào
biểu bì rế ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển.
Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành
lớp phủ dày đặc trên bề mặt rễ.

5


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1: Nấm rễ ngoại cộng sinh
1.2.2. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza)
Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ.
Do đó, các đặc trưng của nấm nội cộng sinh là đối lập với nấm ngoại cộng
sinh như:
 Không hình thành màng ở bề mặt rễ mà chỉ có các sợi nấm lưa thưa.
Tuy nhiên, thể sợi nấm kéo dài giữa các khoảng gian bào, nhưng không hình
thành mạng lưới Hartig.
 Sợi nấm xuyên qua vách tế bào vào trong tạo thành vòi hút.
 Nấm rễ nội cộng sinh thường khó nhận biết bằng mắt thường.

7


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza)
Nấm rễ nội ngoại cộng sinh có đặc trưng của cả 2 loại trên. Chúng
thường có ở các rễ cây thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ
quyên quả mọng (Arbutus) và các cây thuộc chi Nhất hướng khiêm
(Monotropastrum).
1.3. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ
Do sự chọn lọc và tính thích nghi, phạm vi tồn tại cây chủ khác nhau.
Vì thế, một số loài nấm của khu hệ nấm trong đất chỉ cộng sinh với một số
loài trong khu hệ nấm trong rễ chứ không phải tất cả khu hệ nấm trong đất sẽ
cộng sinh với tất cả khu hệ nấm trong rễ. Năm 1995, Tian Chengming chia ra
những loài sống trên 5 loại cây khác nhau gồm 10 loài thuộc họ Amanita,
Cantharenlus; những loài sống trên 2-3 loại cây như Boletus, Ramaria, chỉ
sống trên một loại cây có Suilus, Russula. [37]
Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng
mọc đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần.
Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hoá
khác nhau. Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông,
vân sam, lãnh sam). Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng
(Hymenogaster Albellus) chỉ có ở cây bạch đàn.
Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũng
chọn nấm thích hợp. Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau
của khu hệ nấm vùng đất và rễ để hình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một
loài cây có rất nhiều loại nấm cộng sinh. Có nhiều loài cây như Thông 5 lá,

như của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn

cacbon từ

thực vật dưới dạng đường hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ
thực vật sang nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào.
Tại các sợi nấm nội bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung
cấp glycogen, pentose, lipit… cho hoạt động của nấm. Gần 20% cacbon do
9


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

thực vật tổng hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc
từ thực vật được nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này
góp phần làm tăng thêm nguồn hữu cơ trong đất.
1.4.1. Tăng khả năng hấp thụ P và dinh dưỡng của cây trồng
Cây chỉ có thể hấp thụ P ở dạng hòa tan. Trong khi đó, các dạng P không
tan chiếm tới 1/3-1/2 thậm chí 95-99% lượng P tổng số. Trong các vấn đề sinh
thái và nông nghiệp sự cộng sinh giữa khu hệ nấm trong đất và rễ rất quan
trọng, cây lấy phốt pho chủ yếu từ các loài nấm của khu hệ nấm trong đất và
rễ. AM được coi là mạng lưới của trao đổi phốt pho.
Nấm rễ ngoại cộng sinh có khả năng sản sinh photphotaza chuyển P
không tan thành P hòa tan, cung cấp cho cây trồng. Hoạt tính của enzyme này
ở cây có khu hệ nấm rễ tăng gấp mấy lần so với cây không có khu hệ nấm rễ.
Ngoài ra nấm rễ ngoại cộng sinh thể sản sinh muối oxalat kết hợp với Fe, Al,
muối P không tan trong đất, từ đó làm tăng khả năng hút P của rễ cây. Bên
cạnh việc tăng khả năng hấp thụ phốt pho thì khu hệ nấm trong đất và rễ cũng

nấm cộng sinh tăng 14%. Trong điều kiện khô hạn tuyệt đối, khả năng chống
chịu cũng tăng lên.
Nấm và thực vật có thể sống được trong môi trường có nhiệt độ lên tới
500C, nhưng với điều kiện chúng phải sống cùng nhau. Các nhà nghiên cứu
đã tìm thấy kiểu cộng sinh như vậy xung quanh các suối nước nóng ở công
viên Núi Lửa Lassen và công viên Quốc gia Yellowstone (Mỹ). Loài nấm này
là một thành viên chưa được biết tới trong một họ nấm cộng sinh lớn sống
dưới mặt đất, thuộc chi Curvularia. Chúng quấn quanh rễ của cây chủ - loài
cỏ tắc Dichanthelium lanuginosum chuyên cư ngụ trong các suối nước nóng.
Khi đưa chúng vào phòng thí nghiệm, Russell Rodriguez tại cơ quan nghiên
cứu địa chất Mỹ phát hiện thấy, không loài nào chịu được môi trường đất có
nhiệt độ 50oC nếu chúng đứng độc lập. Tuy nhiên nếu hai loài đó cộng sinh
với nhau, thì chúng có thể chịu được nhiệt độ lên tới 65oC trong những khoảng
thời gian ngắn [34]. Tuy nhiên cơ chế nào giúp chúng chịu được môi trường
11


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

nóng như vậy vẫn còn chưa sáng tỏ. Các tác giả này phỏng đoán, có lẽ mạng
lưới tế bào chằng chịt và rộng lớn của nấm có vai trò tản nhiệt quanh rễ của
thực vật, hoặc có thể cả hai loài này đã trao đổi những chất bảo vệ đặc biệt
nào đó.
1.4.4. Cải thiện môi trường xung quanh cây
Nhiều nghiên cứu điện tử chứng minh rằng chung quanh rễ những cây
thông có nấm rễ xuất hiện tầng kết dính rộng gấp nhiều lần so với cây thông
không có nấm rễ cộng sinh, tầng đó tạo ra khu trao đổi ion, làm cho bộ rễ tăng
khả năng hấp thụ ion và vận chuyển, có lợi cho sinh trưởng của cây.