BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ
ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH
ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ
ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH
ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trƣờng diễn ) ..............................15
4. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................15
5. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...................................................15
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................16
I. Tổng quan về gelatin và gelatinase ........................................................................16
I.1. Gelatin .................................................................................................................16
I.2. Gelatinase............................................................................................................18
I.3. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase .......................................19
I.3.1. Vi khuẩn Pseudomonas ....................................................................................................... 19
I.3.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ......................................................................................... 21

I.4. Tình hình thực tế về nuôi trồng cá da trơn và chế biến các phụ phẩm của cá da
trơn ở Việt Nam ........................................................................................................23
I.5. Thành phần thủy phân từ da cá ...........................................................................25
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................28
II.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................28
II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................................28

3


II.2.1. Vật liệu hóa chất .............................................................................................28
II.2.2. Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp ......................29
II.2.2.1. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính
của gelatinase tái tổ hợp ................................................................................................................ 30
II.2.2.2. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính và độ bền nhiệt của
gelatinase tái tổ hợp ...................................................................................................................... 30
II.2.2.3. Phƣơng pháp xác định pH thích hợp cho hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp .................. 31
II.2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái
tổ hợp ............................................................................................................................................ 31

4


III.1.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ................................. 42
III.1.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ........................ 43

III.2. Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ
hợp .............................................................................................................................44
III.2.1 Các điều kiện tiền thủy phân da cá..................................................................................... 44
III.2.1.1. Kết quả xác định nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/basa .......................................... 44
III.2.1.2. Kết quả xác định pH tiền thủy phân da cá tra/basa .................................................. 45
III.2.1.3. Kết quả xác định thời gian tiền xử lý da cá tra/basa ................................................. 46

III.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân da cá bằng enzyme
gelatinase tái tổ hợp...................................................................................................46
III.2.2. Ảnh hƣởng của chất kiểm soát pH đến quá trình thủy phân da cá bằng
enzyme gelatinase tái tổ hợp .....................................................................................47
III.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân ..............48
III.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân ................................. 49
III.2.5. Phân tích thành phần axit amin trong sản phẩm thủy phân ............................................... 49

III.3. Đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy phân ............50
III.3.1. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ........................................................................... 50
a.

Xác định mật độ vi sinh hiếu khí tổng số ......................................................................... 51

b.

Kết quả định lƣợng mật độ E.coli .................................................................................... 51


Tài liệu tham khảo tiếng Anh ................................................................................................ 68

6


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy
giáo, cô giáo đã và đang giảng dạy tại bộ môn Công nghệ sinh học – Trƣờng Đại
Học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em học tập và hoàn
thành khóa học.
Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thị Tâm và
TS. Đặng Minh Hiếu, là những thầy cô đã trực tiếp hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trợ về tài chính cũng nhƣ phƣơng pháp từ đề
tài cấp Nhà nƣớc mã số KC06.15/11-15. Em xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Công
Nghệ Sinh Học, Viện Sau đại học trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt là
tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà
Nội đã chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em để em thực hiện đƣợc các nội dung của đề tài.
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài em không tránh khỏi đƣợc những
sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn bỏ qua và đóng góp ý
kiến để em hoàn thiện hơn.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh
động viên và giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học này.
Hà Nội, tháng 9 năm 2015
Ngƣời viết luận văn

Đào Văn Nguyên


Bảng 7: Kết quả xác định mật độ Salmonella và Staphylococcus ............................52
trong bột axit amin ....................................................................................................52
Bảng 8: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 15 ngày uống thuốc .............54
Bảng 9: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 30 ngày uống thuốc .............55
Bảng 10: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 60 ngày uống thuốc ...........56
Bảng 11: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó trƣớc 15 ngày dừng ..................57
uống thuốc .................................................................................................................57
Bảng 12: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 15 ngày ..............58
uống thuốc .................................................................................................................58
Bảng 13: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 30 ngày ..............59
uống thuốc .................................................................................................................59
Bảng 14: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 60 ngày uống
thuốc ..........................................................................................................................59
Bảng 15: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó trƣớc 15 ngày dừng
uống thuốc .................................................................................................................60
Bảng 16: Nồng độ albumin trong huyết thanh chó ở các lô thí nghiệm (mg/dl) ......61
Bảng 17: Nồng độ creatinin trong huyết thanh chó ở các lô thí nghiệm (µmol/l) ....62

9


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Thành phần và cấu trúc gelatin ....................................................................17
Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A .................................................................................18
Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B .................................................................................18
Hình 3. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa .............................................20
Hình 4. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas ....................................................................21
Hình 5. Hình thái A. hydrophila ................................................................................22
Hình 6. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila .....................................................................23
Hình 8.a Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase ................................41


kDa

Kilodalton

MMP-2

Matrix metalloprotease 2

MMP-9

Matrix metalloprotease 9

MMPs

Matrix metalloproteases

FDA

Food and Drug Administration
Food and Agriculture

FAO

Organization

bp

Base pair


Tiêu chuẩn Việt Nam
International Organization for

ISO

Standardization

RE

Restriction enzyme

AST

Aspartate transaminase

ALS

Alanine transaminase

CMC

Carboxyl methyl cellulose
Isopropyl β-D-1-

IPTG

thiogalactopyranoside

Amp



Tổng số vi khuẩn hiếu khí

ATVSTP

An toàn vệ sinh thực phẩm

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

BYT

Bộ Y tế

cfu

colony-forming unit

ANOVA

ANALYSIS OF VARIANCE

LSD

Least-Significant Difference

AST

Aspartate amino tranferase

5.500 ha đạt sản lƣợng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm, có kim ngạch 1,76 tỷ USD
trong năm 2014. Cá da trơn đƣợc ƣu chuộng ở nhiều nƣớc trên thế giới do thịt cá da
trơn cung cấp nhiều acid amin và acid béo cần thiết cho cơ thể. Bên cạnh sản phẩm
chính là thịt nạc cá, chủ yếu là phi-lê dạng miếng, còn có nhiều sản phẩm phụ trong
quá trình chế biến nhƣ đầu cá, xƣơng cá và da cá. Đây là nguồn phụ phẩm khổng lồ,
phần lớn chỉ đƣợc sử dụng ở dạng thô sơ làm thức ăn cho gia súc. Nhìn chung, chƣa
có quy định cụ thể nào về tỷ lệ quy đổi từ cá nguyên liệu thành cá phi-lê dạng
miếng, nhƣng theo ƣớc tính cứ 2 – 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến đƣợc 1 kg cá
phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 – 1,5 kg sẽ
nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 – 6% trên tổng lƣợng
phụ phẩm. Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và
có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Đặc biệt là
gelatin, có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm.
Trong sản xuất hiện đại ngày nay, enzyme tái tổ hợp nói riêng và enzyme nói
chung đang là hƣớng đi mới đƣợc ứng dụng vào nhiều ngành khác nhau đem lại
hiệu quả chuyển hóa cơ chất nhanh hơn rất nhiều lần so với phƣơng pháp hóa học
trƣớc kia, phản ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu, đặc biệt an toàn với con ngƣời –
thân thiện với môi trƣờng.
Gelatinase là một trong những enzyme đƣợc nghiên cứu hiện nay để có thể thủy
phân gelatin. Gelatin là một loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có
màu hơi vàng, chúng bị thủy phân ở enzyme gelatinase. Gelatinase đƣợc tách chiết
từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhƣ Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter …

13


Tuy nhiên nguồn gelatinase tách chiết từ vi khuẩn này thƣờng là tác nhân gây nên
ngộ độc của vi khuẩn, đồng thời độc tố của vi khuẩn còn tồn tại có thể gây hại với
con ngƣời và động vật và cây trồng nhƣ vi khuẩn Pseudomonas gây bệnh mủ xanh
ở ngƣời. Vì vậy, sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hƣớng đi mới và có thể giải


ion kim loại

14


3.1.1.2.

Xác hoạt tính, độ bền nhiệt độ, độ bền pH của gelatinase tái tổ hợp

3.1.2. Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng
gelatinase tái tổ hợp
3.1.2.1.

Nghiên cứu các điều kiện tiền thủy phân da cá da trơn ( cá tra/ cá basa

)
3.1.2.2.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân da cá tra/

cá basa
3.1.2.3.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân da cá tra/

cá basa
3.1.3. Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin
thủy phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trƣờng diễn )
3.1.3.1.


PHẦN II – NỘI DUNG
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. Tổng quan về gelatin và gelatinase
I.1. Gelatin
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xƣơng của
bò, lợn, cá. Trong tự nhiên, gelatin đóng vai trò nhƣ một nguồn nitơ giàu dinh
dƣỡng, rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin tạo ra peptide và acid
amin để xây dựng cấu trúc cơ thể của chúng. Hiện nay, gelatin có nguồn gốc từ da
cá đang đƣợc xác định là nguồn cung cấp chính cho nhu cầu sử dụng gelatin, do nó
giải quyết vấn đề xử lý chất thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng. Gelatin
đƣợc thu nhận từ sự biến tính nhiệt phân collagen có trong da, xƣơng, mô liên kết
của động vật, là một loại protein phổ biến trong giới động vật. Gelatin hòa tan khi
đun nóng (khoảng 40oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nƣớc ở điều kiện bình
thƣờng có dạng sệt. Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân
Collagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O



C102H151N31O39 (gelatin)

Gelatin là một protein tạo bởi axit amin sắp xếp trên một chuỗi đƣờng thẳng
và đƣợc liên kết bởi sự kết hợp của hai hay nhiều axit amin, là hỗn hợp dị hể các sợi
polypeptid sợi đơn và sợi đa, mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ
300 – 400 amino acid. Cấu trúc của gelatin đƣợc hình thành từ sự liên kết của 18
loại amino acid khác nhau, liên kết theo một trạt tự nhất định, tuần hoàn. Gelatin
chứa một lƣợng lớn glycine, proline và 4- hydroxyproline.

16

cầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng. Chức năng chính của
gelatinase là phối hợp với các MMPs khác để chỉnh sửa các mô sinh dƣỡng, hỗ trợ
sự phát triển của phôi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng,
chữa lành vết thƣơng, tham gia hình thành xƣơng.
Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thƣ, gelatinase 92

Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A

Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B

18


kDa đƣợc sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, còn trong chẩn
đoán, gelatinase là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u.
Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lƣợng phân tử là 72 kDa,
với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn2+, hoạt động chính của enzyme này là thủy
phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin
các chủng sản sinh gelatinase (bảng 2)
Bảng 2. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
Tên loài

Hoạt tính Gelatinase

Staphylococcus aureus

+

Bacillus subtilis


Serratia rubidaea

+

Peudomonas anguilliseptica

+

I.3. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
I.3.1. Vi khuẩn Pseudomonas
Phân loại khoa học
Giới (Domain): Bacteria
Ngành (phylum): proteobacteria
Lớp (class): Gramma proteobacteria
Bộ (ordo) : Pseudomonadales

19


Họ (familia): Pseudomonadaceae
Chi (genus): Pseudomonas
Migula(1894)
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans ,
Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn
Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên
mao) và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dƣỡng, không lên men, linh
hoạt về dinh dƣỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Chúng thƣờng sinh ra
sắc tố, các sắc tố này thƣờng biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gây

I.3.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadacea
Giống: Aeromonas

21


Loài: A.hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích
thƣớc chiều rộng thƣờng từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng không
có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ thấp (4oC). A.
hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn. Trong
một số điều kiện sinh trƣởng nhất định một số tế bào có thể có tiên mao ở một bên.

Hình 5. Hình thái A. hydrophila
Đƣợc xếp vào nhóm sinh vật dị dƣỡng. Loài này chủ yếu đƣợc tìm thấy trong
các vùng khí hậu nhiệt đới nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc...
và Việt Nam. Chúng phân bố nhiều trong các vùng nƣớc ngọt, nƣớc lợ, mặn, ở các
cửa sông... ngoài ra còn có thể bắt gặp loài này trong các nguồn nƣớc có chứa clo và
các hợp chất khác có hay không có clo. Vi khuẩn này phổ biến hơn trong môi
trƣờng nuôi cá nƣớc ngọt. Nó đƣợc tìm thấy cả trong tầng nƣớc đứng và lớp trên
cùng của lớp trầm tích (Hazen 1979). Cho tới những năm 1950, ngƣời ta mới phân
lập đƣợc loài này trên ngƣời và 1 số động vật. A.hydrophila là loài đƣợc biết đến
nhiều nhất trong 6 loài thuộc Aeromonas . Nó có thể tiêu hóa các vật liệu nhƣ
gelatin và hemoglobin. Nó có khả năng thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của
môi trƣờng nhƣ: có thể sống đƣợc trong môi trƣờng có chứa clo, bị làm lạnh, hay
nhiệt độ thấp, vì vậy loài này rất khó bị tiêu diệt.

làm tăng sản lƣợng cá nuôi nƣớc ngọt trong cả nƣớc, tăng thêm lƣợng thủy sản xuất
khẩu và góp phần phát triển ổn định nghề nuôi. Tuy nhiên, theo báo cáo của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, diện tích nuôi trồng của Việt Nam biến động
khá lớn trong năm năm trở lại đây. Lý do chính về vấn đề này có lẽ phụ thuộc vào
tốc độ xuất khẩu. Thông thƣờng, diện tích nuôi trồng sẽ tăng khi xuất khẩu tăng và
ngƣợc lại. Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan tâm hơn tới việc tăng doanh thu
từ các nguồn khác nhƣ các mặt hàng chế biến sẵn, các mặt hàng giá trị gia tăng, tận
dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử dụng cho phế phẩm. Mặt khác,
nếu không tận thu lƣợng phụ phẩm sau chế biến này sẽ gây thất thoát lãng phí lớn
trong sản xuất và ô nhiễm môi trƣờng. Trong khi đó, chúng ta lại hoàn toàn có thể
tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủy phân có khả năng ứng dụng
rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sản xuất nông nghiệp… đáp ứng
đƣợc một lƣợng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các sản phẩm chống lão hóa,
các sản phẩm làm đẹp, dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, thức ăn nuôi trồng thủy
sản hay các sản phẩm sử dụng trong nông nghiệp.
Thành phần chính của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý. Da
chứa 85% collagen, một loại protein có 19 axit amin, trong đó có 8 axit amin không
thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hoàn chỉnh, trong đó axit amin
glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lƣợng axit amin trong
collagen.
Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành axit amin, enzyme gelatinase đƣợc
coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an toàn và ít gây ô nhiễm môi

24


trƣờng. Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng
Tháp là công ty đầu tiên trong nƣớc đầu tƣ, xây dựng nhà máy để chiết xuất các sản
phầm từ da cá da trơn với công suất 2000 tấn/năm, trong đó có 1.000 tấn là collagen
và 1.000 tấn là gelatin (Công ty CP Vĩnh Hoàn - Báo cáo thƣờng niên, 2014)