BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

PHAN THỊ HƯƠNG TRÀ

ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH DỊCH TỄ
HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENES
ĐƯỢC PHÂN LẬP TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ QUANG HÒA

HÀ NỘI - 2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận nghiên cứu này sẽ không có thể thực hiện được nếu không có sự hỗ
trợ của nhiều người. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Lê Quang Hòa
– Phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử - Viện CNSH & CNTP – Trường ĐHBK Hà
Nội, người đã hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian làm việc ở phòng thí nghiệm
và luôn sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.

1

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................0 
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................1 
MỤC LỤC..................................................................................................................2 
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................5 
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................6 
PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................8 
I.1. Tổng quan về L. monocytogenes ........................................................................8 
I.1.1. Các đặc tính cơ bản của L. monocytogenes ...................................................8 
I.1.1.1. Đặc hình thái .................................................................................................9 
I.1.1.2. Đặc tính sinh lý ...........................................................................................10 
I.1.1.3. Đặc tính sinh hoá ........................................................................................11 
I.1.1.4. Đặc tính huyết thanh học ...........................................................................12 
I.1.1.5. Đặc điểm về cấu trúc phân tử và con đường xâm nhiễm .......................14 
I.1.2. Con đường lây nhiễm và bệnh do L. monocytogenes gây ra......................21 
I.1.2.1. Con đường lây nhiễm L. monocytogenes ..................................................21 
I.1.2.2. Bệnh do L. monocytogenes gây ra .............................................................22 
I.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do L. monocytogenes gây ra......................24 
I.1.3.1. Trên thế giới ................................................................................................24 
I.1.3.2. Ở Việt Nam..................................................................................................28 

I.3.2.4. Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên trình tự DNA .......................50 
I.4. Các phương pháp xác định độc tính của L. monocytogenes .........................51 
I.4.1. Thử nghiệm độc tính trên chuột...................................................................51 
I.4.2. Thử nghiệm độc tính bằng các dòng tế bào ................................................52 
I.4.3. Xét nghiệm dựa trên các gen và protein liên quan tới độc tính ................53 
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................55 
II.1. Vật liệu .............................................................................................................55 
II.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................55 
II.1.2. Chủng vi sinh vật .........................................................................................55 
II.1.3. Hóa chất ........................................................................................................56 
II.1.4. Thiết bị ..........................................................................................................57 
II.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................57 
II.2.1. Xây dựng quy trình phân lập L. monocytogenes từ thực phẩm...............57 
II.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh từ mẫu thực phẩm ban đầu ...................................57 
II.2.1.2. Giai đoạn chọn lọc trên môi trường rắn .................................................57 
II.2.1.3. Giai đoạn tăng sinh thuần chủng và bảo quản giống ............................61 
II.2.1.4. Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L. monocytogenes.............61 
II.2.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được ...............63 
II.2.2.1. Thu DNA làm khuôn cho phản ứng PCR...............................................63 

3

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

II.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR.........................................................................63 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu

Tên đầy đủ

1

aw

Water activity (hoạt độ của nước)

2

DNA

Axit Deoxyribonucleic

3

bp

Base pair (cặp bazơ)

4

dNTP

Deoxynucleotide


10

PCR

Polymerase Chain Reaction

11

PEG

Polyetylen Glycol

12

TAE

Tris - Acetate - EDTA

13

TE

Tris - EDTA

14

PBS

Phosphate Buffered Saline- muối đệm phosphate

Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là một trong những vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm
trên cả người và động vật. Trong tự nhiên, L. monocytogenes có phạm vi phân bố
khá rộng, có thể được tìm thấy ở nhiều nơi như đất, nước, thực vật, nhiều loại thực
phẩm, thức ăn gia súc và có cả trong phân người hoặc phân động vật. Một đặc tính
đặc biệt của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong điều
kiện nhiệt độ thấp nên các mặt hàng đông lạnh như thịt, xúc xích, các sản phẩm bơ,
sữa …có nguy cơ cao bị nhiễm loại vi khuẩn này .
Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là listeriosis. Đối tượng có
nguy cơ bị nhiễm bệnh cao thường là những người có hệ thống miễn dịch hoạt động
kém như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi hoặc các bệnh nhân mắc hội
chứng suy giảm miễn dịch. Hậu quả của bệnh gây ra rất lớn. Trong giai đoạn đầu
tiên khi bị nhiễm bệnh, người bệnh thường biểu hiện các triệu chứng lâm sàng
không đặc trưng giống như người bị cảm cúm thông thường (như ớn lạnh, mệt mỏi,
đau đầu, mỏi cơ và xương) – chính vì vậy người ta thường không nhận biết được
ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. Nếu độc tính đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ
độc thực phẩm cấp tính với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, viêm dạ dày.
Tuy nhiên, khi không được điều trị kịp thời bằng thuốc kháng sinh, chúng có thể
phát triển gây nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và có thể gây tử vong.
Với tỷ lệ tử vong cao, lên tới gần 30%, L. monocytogenes nguy hiểm hơn rất nhiều
so với các tác nhân gây bệnh thông qua thực phẩm phổ biến như Salmonella (với tỷ
lệ tử vong 0,38%), Campylobacter (0,02-0,1%) và Vibrio (0.005-0,01%).
Vi khuẩn L. monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác
nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Các ca
nhiễm bệnh do L. monocytogenes đã xảy ra ở các nước Châu Âu, Châu Mỹ, Châu
Phi cũng như các nước trong khu vực Châu Á và có xu hướng ngày càng tăng.


7

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

PHẦN I. TỔNG QUAN
I.1. Tổng quan về L. monocytogenes
I.1.1. Các đặc tính cơ bản của L. monocytogenes
L. monocytogenes là một loại vi khuẩn có thế khiến phụ nữ mang thai bị sẩy
thai, gây ra bệnh viêm màng não ở người già hoặc những người có hệ miễn dịch yếu
[51].
L. monocytogenes được biết đến lần đầu tiên vào năm 1911 khi Hulpher, nhà
vi sinh vật học Thụy Điển, phân lập được một loài vi khuẩn từ bệnh hoại tử gan thỏ
và ông đặt tên là Bacillus hepatic. Các đặc tính của loài vi khuẩn do Hulpher mô tả
cho thấy nó rất giống với L. monocytogenes. Năm 1926, Muray đã đặt tên
monocytogenes cho loài này và các đồng nghiệp của ông cho rằng đây là một loài
bacillus mới có khả năng hoạt động sinh monocytosis (hiện tượng tăng lượng bạch
cầu quá mức bình thường) ở thỏ và chuột lang. Đồng thời vào năm 1927, Pirie trong
quá trình nghiên cứu nguyên nhân gây ra bệnh dịch đối với động vật ở Nam Phi đã
phát hiện ra một vi sinh vật mới và đặt tên là Listerella hepatolytica. Hai tác giả
Murray và Pirie cùng gửi chủng của họ tới NCTC (National Collection of Type
Cultures) ở London. Sự giống nhau về các đặc tính của hai chủng này dẫn đến kết
quả Murray và Pirie đã thống nhất gọi vi khuẩn này là Listerella monocytogenes.
Năm 1929, Nyfeldt đã lần đầu tiên phân lập loài vi khuẩn này từ người. Sau đó,
Pirie đã đề xuất đổi tên từ Listerella monocytogenes thành L. monocytogenes [51].


Bacilales

Họ

Listeriaceae

Chi

Listeria

I.1.1.1. Đặc hình thái
L. monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, có khả năng di chuyển kích
thước dao động từ (0.4-0.5) x (0.5-2) µm. Các tế bào L. monocytogenes có thể tồn
tại độc lập hoặc tạo chuỗi ngắn. Thông thường các tế bào có dạng hình que dài
nhưng trong một số điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu với đường
kính trung bình khoảng 0.5 µm.
Loài vi khuẩn này không hình thành capsul và không sinh bào tử. Do có các
lông roi nên L. monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trường.
Khi nuôi cấy ở 20-250C trong tiêu bản giọt treo, vi khuẩn L. monocytogenes di động
xoay tròn thành đợt còn trong môi trường thạch mềm chúng di động tạo thành dạng
một chiếc ô cách bề mặt vài mm [51].

Hình 1.Vi khuẩn L. monocytogenes
9

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

L. monocytogenes có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối
khá cao 10-12%. Loài vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trong môi trường có nồng độ

10

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

muối vừa phải (6,5%). Khả năng chịu được nồng độ muối cao của

L.

monocytogenes tăng khi nhiệt độ nuôi cấy càng thấp[51].
Farber và Hartwing đã tổng kết các điều kiện tại đó L. monocytogenes không
thể phát triển trong các loại thực phẩm ăn liền là:
pH 5,0-5,5 và aw < 0,95
pH

+

+

+

+

Catalase

+

+

+

+

+

+

Oxidase

-

-

-


-

-

β-haemolysis

+

+

-

-

+

-

Thử nghiệm CAMP (S. aureus)

+

-

-

-

+


D-xylose

-

+

-

+

+

-

β-methyl-D-mannoside

+

-

+

+

-

+

Mannitol


+

+

+

+

+

Gây bệnh cho chuột

+

+

-

-

-

-

Đặc tính

Khả năng tạo axit từ:

-: 90% số chủng cho phản ứng âm tính

A, B

1/2b

I, II

A, B, C

1/2c

I, II

B, D

3a

II, IV

A, B

3b

II, IV

A, B, C

3c

II, IV


A, B, C

7

XII, XIII

A, B, C

5

(V), VI, (VIII), X

A, B, C

6a

V, (VI), (VII), (IX), XV

A, B, C

6b

(V), (VI), (VII), IX, X, XI

A, B, C

13

Công nghệ sinh học 2008-2010


Các internalin đáng chú ý nhất là InlA và InlB.

14

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

Bảng 4. Các nhân tố quyết định tính độc của L. monocytogenes
Kích
Gene

Protein

thước
( bp)

Khối

Khối

Số axit

lượng

lượng


867

289

29

29

plcA

PI-PLC

95 1

317

36.3

34

10.1

mpl

Mpl

1533

5 10


4.2

inlCh

InlC

891

297

29.6

30

6.7

inlB

InlB

1890

630

71.1

65

10.1


LLO

1617

529

58.6

58

4.2

clpc

ClpC

2478

826

91.0

1464

488

55.9

67


¾ InlA và InlB
Các protein bề mặt InlA (Internalin A) và InlB (Internalin B) được mã hóa bởi
gen inlA và inlB thuộc một họ gen ngoài nhiễm sắc thể, là những protein có vai trò
trong sự xâm nhập vào các tế bào biểu mô của vi khuẩn này.
InlA có 800 axit amin và có chứa hai vùng lặp lại: vùng LRR gồm 22 axit
amin lặp đi lặp lại liên tiếp 15 lần và một vùng gồm 70 axit amin lặp lại 2 lần. InlA
tương tác với E- cadherin để làm trung gian giúp L. monocytogenes xâm nhập vào

16

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

các tê bào biểu mô. Vùng đầu cacbon linh động của InlA có khả năng liên kết đồng
hóa trị với thành tế bào, khi vắng mặt vùng này hoặc vùng này bị loại bỏ, protein
InlA bị tách ra hoàn toàn và khả năng xâm nhiễm của một vài chủng bị suy giảm
đáng kể.
Protein InlB có 630 axit amin giúp nhận biết C1q-R (hoặc Met) tạo điều kiện
cho L. monocytogenes xâm nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm cả tế bào
gan, nguyên bào sợi và một vài tế bào biểu mô (Vero, HeLa, HEp-2, CHO và tế bào
L2). InlB có các vùng lặp lại tương tự InlA và đầu cacbon của protein này bám với
bề mặt tế bào tạo thành 3 vùng lặp lại của các module GW (lặp lại bắt đầu bằng
dipeptide GW). Vùng tương tự LRR có mặt ở protein InlB cũng hoạt hóa
phosphoinositide kinase (PI), một lipid kinase cần cho sự xâm nhiễm gián tiếp của
InlB đối với các tế bào chủ. Sự xâm nhập vào tế bào chủ của L. monocytogenes
không bị các hoạt động của hệ miễn dịch phát hiện [61].

dụng một phần của khung tế bào gọi là các sợi actin, Vi khuấn Listeria có mày xanh
và sợi actin màu đỏ. Qua ảnh có thể nhận thấy rằng sợi actin hình thành một cấu
trúc dạng đuôi phía sau vi khuẩn. Những sợi actin này có tác dụng đẩy Vi khuẩn
Listeria qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người. Những mũi tên trong ảnh cho
thấy một con vi khuẩn đang chuyển động trong tế bào chất.
InlC đóng vai trò quan trọng trong quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi
khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh. Thông thường, màng tế bào hay lớp ngoài
cùng của những tế bào khỏe mạnh căng ra. Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có
tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm
bệnh liền kề. Tuy nhiên, với sự có mặt của InIC làm giảm đi độ căng của màng tế
bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để
xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe manh liền kề dễ
dàng hơn.
¾ Listeriolysin O
Khi đã xâm nhập đưsợc vào bên trong một không bào của tế bào chủ, L.
monocytogenes có thể thoát ra khỏi không bào một cách nhanh chóng và chuyển
vào trong tế bào chất, ở đó chúng sẽ sinh trưởng và phát triển. Nhân tố chính liên
quan tới việc dung giải không bào là một protein có khả năng phá hủy không bào
tạo thành dạng lỗ thủng. Protein này có tên là listeriolysin O (LLO).

18

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

LLO là một độc tố thuộc nhóm có độc tố chứa nhóm thiol (-SH). Nhóm độc tố


Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

động phối hợp với PC-PLC hỗ trợ LLO trong quá trình dung giải không bào sơ cấp.
Do đó, cả hai loại PLC có vai trò trong việc giải phóng L. monocytogenes thoát khỏi
không bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác [11].
¾ ActA
Sau khi đã thoát ra khỏi không bào, L. monocytogenes đi vào tế bào chất, ở
đây chúng trải qua quá trình phát triển và tăng sinh trong tế bào. Để biến đổi và
phân chia bên trong tế bào, L. monocytogenes cần một protein bề mặt khác là ActA.
ActA không đặc trưng cho L. monocytogenes mà là một protein cấu thành sợi lông
có 639 axit amin, khối lượng 67-kDa được tìm thấy ở tất cả các tế bào nhân thật.
Gen actA mã hóa protein bề mặt ActA, là một nhân tố duy nhất cần thiết cho khả
năng di chuyển của vi khuẩn.
Khi các đầu sợi actin đẩy vi khuẩn tới màng sinh chất tế bào chủ của chúng,
màng sẽ trở nên căng phồng và tạo thành vị trí nhô ra bên trong khoảng trống nội
bào. Khi vị trí màng có bám vi khuẩn của một tế nào đã nhô sang một tế bào bên
cạnh thì quá trình lan truyền sẽ diễn ra. Tuy nhiên, ở vị trí này tế bào vi khuẩn bị
bao quanh bởi một không bào màng kép, trong đó một màng là của tế bào cho và
màng còn lại của tế bào nhận vi khuẩn. Sự phá hủy màng kép này đòi hỏi phải có sự
tham gia của LLO, PI-PLC, PC-PLC và một metalloprotease mã hóa bởi gen mpl.
Sau khi phân giải màng kép này một vòng mới gồm di chuyển trong nội bào và lan
truyền của vi khuẩn lại được bắt đầu.
¾ PrfA
Toàn bộ các bước trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes được diễn ra

trên nhiễm sắc thể, hai gen còn lại là inlA và inlB thuộc một họ đa gen và nằm tại
một operon khác. Ngoài ra, gen iap mã hoá protein p60 cũng tham gia trong quá
trình xâm nhiễm của L. monocytogenes.
I.1.2. Con đường lây nhiễm và bệnh do L. monocytogenes gây ra
I.1.2.1. Con đường lây nhiễm L. monocytogenes
L. monocytogenes là một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cả người và
động vật. Chúng là một trong số ít các loài có phạm vi phân bố rộng. Có thể tìm
thấy loài này ở nhiều nơi như: đất, thức ăn gia súc, nước, thực vật, nhiều loại thực
phẩm và trong phân người và phân động vật. Những thực phẩm thường bị nhiễm L.
monocytogenes là: xà lách trộn, sữa thanh trùng, tiệt trùng, pho mát mềm, patê, thịt
lợn đóng gói và xúc xích. Do thời gian ủ bệnh lâu dài nên

việc xác định nguồn

thực phẩm gây dịch bệnh listeriosis thường rất khó khăn. Người ta cho rằng một số
chủng L. monocytogenes phân lập được ở trẻ sơ sinh bắt nguồn từ bệnh viện do sử
dụng những dụng cụ bị nhiễm khuẩn. Những người trồng rau và tiếp xúc gần gũi
với động vật bị nhiễm khuẩn cũng dễ mắc bệnh. Hình dưới đây mô tả các con
đường lây nhiễm của L. monocytogenes trong thực phẩm.

21

Công nghệ sinh học 2008-2010


Luận văn thạc sĩ

Phan Thị Hương Trà

Hình 5. Sơ đồ phân bố L. monocytogenes trong chuỗi thực phẩm từ môi

sinh.
Nhìn chung, listeriosis chủ yếu xảy ra đối với phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh và
những người trưởng thành có hệ miễn dịch bị tổn thương nhưng cũng có thể xảy ra
đối với những người bình thường. Thống kê ở Pháp năm 2008 cho thấy tần suất
mắc bệnh listeriosis là 4,8 ca/1.000.000 dân và có xu hướng ngày càng gia tăng [8].
Listeriosis xảy ra dễ dàng hơn gấp 300 lần ở người mắc hội chứng suy giảm miễn
dịch (AIDS) so với những người bình thường. Phụ nữ mang thai dễ bị nhiễm L.
monocytogenes có lẽ là do sự thay đổi về miễn dịch tại chỗ và toàn thân trong thai
kỳ.
Ở phụ nữ mang thai, hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn đều xảy ra vào 3
tháng cuối của thai kỳ. Đa số phụ nữ mang thai bị nhiễm L. monocytogenes có dấu
hiệu sốt, mệt mỏi và đau lưng, có khi thấy tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn hoặc nôn
trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn đến
nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng đệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở
giai đoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sảy thai tự nhiên. Trẻ
sơ sinh tuần lễ đầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở
những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn đặc trưng bởi những ổ áp-xe
rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác. Một số trẻ sơ
sinh phát bệnh ở giai đoạn muộn thường bị viêm màng não nhiều hơn so với trẻ
khởi phát ở giai đoạn sớm. Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai đoạn sớm thường đi
kèm với những biến chứng sản khoa như sinh non và viêm màng đệm và màng ối
[1].
Nhiễm khuẩn L. monocytogenes còn xảy ra ở những người suy giảm miễn
dịch, nhất là những người điều trị lâu dài bằng glucocorticoid, có khối u ác tính
hoặc bệnh lý máu ác tính, đái tháo đường, bệnh thận, bệnh gan và AIDS. Nhiễm
khuẩn huyết là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất ở những người bị tổn thương hệ

23

Công nghệ sinh học 2008-2010