NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM RPS XỬ
LÝ LIGNIN – CELLULOSE TRONG VỎ CÀ PHÊ
THÀNH PHÂN HỮU CƠ
Lời mở đầu
I tổng quan tài liệu
I.1. nghiên cứu ligin – cellulose(lc) trong vỏ cà phê( thành phần hóa học vỏ cà
phê)
Thành phần chủ yếu của tế bào thực vật là xenlulo, hemixenlulo và lignin
I.1.1 Xenlulo.
Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 505 tổng lượng
hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn có trong giới
động vật, nhưng số lượng rất ít. Xenlulo là polysacarit gồm có anhydro- D- …..
liên kết với nhau bằng lien kết -1,4-glucozit, mức độ polyme hóa của Xenlulo rất
cao tới 10000-14000 đơn vị glucoza/ phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và
gian phân tử làm cho phân tử Xenlulo có độ cứng và vững chắc
Liên kết glucozit không bền với acid. Xenlulo dễ bị phân hủy bởi acid và tạo
thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro- Xenlulo có độ bền cơ học
kém hơn Xenlulo nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo
thành là D-glucoza
Về bản chất hóa học Xenlulo là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim
loại kiềm tạo thành xenlulo-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc
một và hai trong phân tử Xenlulo cũng có thể bị thay thế bởi các gốc – metyl,
-etyl, … tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác
nhau.
Xenlulo cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một
phần là oxy- Xenlulo. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO
4
), và
muối của nó. Xenlulo không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng
mạch Xenlulo và hòa tan một phần Xenlulo phân tử nhỏ. Đặc biệt Xenlulo dễ
hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat (Cu(NH

một chất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin là sản phẩm ngưng
tụ của 3 thành phần chủ yếu rượu trans-p-cumaryl, trans-coniferyl, trans-cynapyl
theo tỷ lệ khác nhau tùy loại thực vật. lignin của cây gỗ thực vật mềm điển hình
(cy vn sm) gồm cĩ 80 conyferyl, 14 cumaryl và 6% coniferyl. Lignin của cây gỗ
cứng gồm lượng bằng nhau của conyferyl và cynapyl, cịn cumaryl khiếm tỷ lệ
rất nhỏ.
Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kết và
loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa monome là
kiểu liên kết aryl-glyxerol--aryl ete. Ngồi ra cịn cc kiểu lin kết phenyl-cumaryl,
biphenyl, diarylete. Vì dẫn suất của cc hợp chất thơm có mạch bên với nhiều
nhớm chức hoạt động, đặc biệt là OH của nguyên tử cacbon(đối với vịng thơm)
nên lignin có thể tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với
xenlulo và hemixenlulo, như các phản ứng thế( clo hóa), phản ứng este hóa, oxy
hóa, dimetyl hóa.
Hịa tan tốt trong dung dịch kiềm nóng, một phần trong dung môi hữu cơ
I.1.4. Lignin-xenlulo tự nhiên là một cơ chất khó phân hủy
Mỗi thnh phần cấu tạo nn lignin- xenlulo riêng, do bản chất các kiên kết hóa học,
do mức độ polyme hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy.
tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và với
các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp
Cc mạch phn tử xelulo khơng bao giờ tồn tại ring lẻ m nhờ lin kết hydro gian
phn tử tạo thnh các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợi có những vùng tại
đó các phân tử sắp xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẽ những
vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Cc vi sợi lin
kết với nhau bằng cch đan xen ở những vùng vô định hình ny.
Các vi sợi xenlulo, lignin, hemixenlulo theo những quy tắc những quy tắc nhất
định để hình thnh nn cấu trc vi sợi. với cấu trc nhiều lớp gồm cĩ nhiều thnh phần
cĩ bản chất hĩa học khc nhau như vậy, lignin-xenlulo có độ bền vật lý cao rất khó
xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành
phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành

I.2. Các enzyme phn hủy cellulose
I.2.1.Thành phần và cơ chế tác động
a) endo – 1,4--D- glucanaza không tấn công vào X kết tinh tấn công vào X
vô định hình v CMC cũng như các xenlo-oligosacarit mạch dài
b) exo – 1,4- -D- glucanaza tấn công X kết tinh, X vô định hình v xenlo-
oligosacarit, CMC thì khơng.
c) Xenlobiozan ( glucozidaza) chỉ thủy phn xenlobioza v xenlo- oligosacarit
mạch ngắn, glucoza l sản phẩm thủy phn duy nhất v l chất kiềm chế
Theo cơ chế này đầu tiên endo – glucanaza tấn công vào các vùng vô định hình
trn bề mặt xenlulo cắt cc lin kết – 1,4 – glucozit tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp
đến exo – glucanaza tấn công cắt ra từng đoạn 2 đơn vị glucoza, từng mạch đơn
tạo thành. Kết quả tác động của endo-exo glucanaza lm xuất hiện cc xenlo-
oligosacarit mạch ngắn, xenlobioza v cả glucoza, xenlobiza thủy phn tiếp tạo
thnh glucoza.
I.2.2.Sinh tổng hợp cellulase ở nấm
Trong điều kiện hiếu khí, vai trị chính phn giải lignin-cellulose thuộc về nấm
mục nâu và nấm mục trắng. cơ chất bị phân hủy hóa nâu là do lignin tích lũy.
Nấm mục trắng phân giải tất cả các thành phần đó.
Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật
Trong tự nhiên có rất nhiều loài sinh vật có khả năng sinh ra cellulsae, nhưng
nguồn quan trọng và có khả năng phân hủy cao vẫn là nấm, chúng dễ dàng phát
triển trên môi trường đơn giản giải phóng nhiều nhiều enzyme cellulase có hiệu
quả phân hủy cao cellulose
Nhiều tác giả khẳng định cellulase có cơ chất cảm ứng tốt là cellulose, lactoza,
…
Nhưng có một số tác giả lại đưa ra bằng chứng cho rằng cellulase là một enzyme
cấu trúc: có thể tộng hợp cellulase trên môi trường không có cellulose hay các
chất cảm ứng thích hợp. đúng hơn cả cần phải coi sự tổng hợp cellulase có tính
cảm ứng không chặt chẽ. Quan niệm này phù hợp với thực tế và cũng logic khi
cellulose là cơ chất không tan trong nước, phân tử lớn, bản thân nó không thể

NAD, NADP đ được chứng minh là có vai trị trong qu trình phn giải lignin
Eggling nhận thấy rằng tính oxy hóa rất mạnh và không đặc hiệu của các tác
nhân phân giải lignin. Tác giả này cũng gi thiết vai trị quan trọng của gĩc OH.
Ơng cho rằng gốc tự do ny tham gia vo nhiều phản ứng sinh hĩa trong cc phản
ứng của qu trình phn giải lignin, gĩc
.
OH cĩ thể sinh ra từ H
2
O
2
,
O
2
-
+ H
2
O
2
O
2
+OH
-
+
.
OH
Trong vỏ cà phê có đầy đủ điều kiện để nấm tạo ra H
2
O
2
v tiến hnh phản ứng ny,

chất thứ cấp, các tác giả cũng cho rằng các hoạt động trao đổi chất thứ cấp trong
đó có cả phân giải lignin được khởi đầu bằng sự hạn chế dinh dưỡng và việc bổ
sung dinh dưỡng thường hạn chế sự phân giải
I.3. Lên men rắn và định hưĩng sản xuất chế phẩm RPS
I.3.1. sơ lựoc lịch sử - đặc điểm của phưong php ln men rắn
Tên này được sử dụng đầu tiên vào năm 1977 để phân biệt với tên len men lỏng
hay chìm
Ln men chìm rắn chỉ l sự mơ phỏng một dạng sinh thi của sự tồn tại v hoạt động
của vi sinh vật tự nhiên, thường xảy ra trong quá trình phn giải hiếu khí cc cơ
chất không hịa tan
Sau khi qu trình nghin cứu của takamine sử dụng phương pháp lên men rắn hạt
ngũ cốc và cám bằng aspegillus niger để sản xuất amylaza. Vào đầu thế kỷ 20 thì
phương pháp này được sử dụng rộng ri trong cơng nghệ vi sinh ở u Mỹ
Đặc điểm:
Tồn bộ mơi trường là khối cơ chất xếp rắn, nước rất ít, lớp mỏng trên bề mặt
Hoạt động sống của vi sinh vật chủ yếu trên bề mặt, sự trao đảo khí và nhiệt hầu
như trực tiếp giữa pha rắn và pha khí.
Ưu điểm và nhược điểm
Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được một khối
lượng lớn cơ chất 4-5 lần lên men lỏng
Môi trường rắn dễ bảo quản
Lượng nước ít nên tiêu hao năng lượng cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít
Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm
Địi hỏi thiết bị v kỹ thuật đơn giản
Tuy mức độ sử dụng cơ chất và chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm thấp nhưng
tính theo mật độ cơ chất thì năng suất vẫn cao
Nhược điểm:
Khí, nhiệt bị hạn chế vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc phục khó
do khối lượng lên men lớn
I.3.2. Các kiểu lên men rắn

C cho đến khi độ ẩm <8%,đưa vào bao,hàn
kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.
2.Tỉ lệ phối trộn:
Qua khảo sát sự phát triển sợi tơ của 3 chủng dòng sau bằng phương pháp lại
mà chúng tôi sẽ trình bày ở mục(II.2.1),chúng tôi chọn được chủng lai tạo
sau[4]:
.Phanerochaete Chrysosporium36201.(PC36201)
.Lentinula edodes.(LE-C).
.Schizophyllum Commune(SC).
Tốc độ phát triển sợi tơ và khả năng phân giải lignin-cellulose của 3 nòi trên dựa
trên sự phối trộn kết quả (Kirschoff và cộng sự 2000) :
Trên môi trường CMC có bố sung 10% cám,30% vỏ cà phê xay nhuyễn,60%
mùn cưa.
Tỉ lệ phối hợp Lignin(%) Cellulose(%)
PC:LE:SC= 1:2:>=3 70% 60%
1:1:3 60% 50%
1:2:1 65% 55%
1:1:1 95% 99,8%
2:1:1 38% 47%
Kirschoff và cộng sự đã nghiên cứu sự 3 chủng phối hợp sau thời gian 33 ngày
,cho thấy sự phân giải cực mạnh gần như hoàn toàn lignin –cellulose(LC),khi cố
định(1)PC36021 tăng hàm lương mật độ của 2 chủng còn lại(2,3) 10
4
bào tử/ml
dịch môi trường nuôi.
Thêm vào đó là sự ảnh hưởng của pH cũng đóng vai trò quan trọng cho tốc độ
phân giải trên như sau: [7] ,PC36201 chỉ hoạt động mạnh ở pH từ 6,5-7,5 trong
khi đó LE và SC hoạt động tốt ở pH 4,5-5 (Ling hue và Mathodoes 1999).