KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CNSH&KTMT
BỘ MÔN CNSH

MÔN : KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRINH SINH HỌC
TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT
PROTEASE KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS
VỚI CÔNG SUẤT (NHÀ MÁY) 200 TẤN/NĂM

GVHD : Nguyễn Thị Quỳnh Mai
Thực hiện: Nhóm 12

Nguyễn Thị Trúc Phương

2008140224

Nguyễn Bảo Linh

2008140149

Nguyễn Thị An

2008140324

Lỹ Thị Diễm Trang

2008140324

Lê Thị Mỹ Trinh


Bể phản ứng: ...................................................................................................................................... 6
2.1.

Giới thiệu:............................................................................................................................................... 6

2.2.

Thời gian tới hạn đối với oxi:................................................................................................................ 6

2.3.

Bể khuấy trộn: ....................................................................................................................................... 7

2.4

Thang không khí .................................................................................................................................... 8

2.5

Cột bọt .................................................................................................................................................... 8

2.6

Xác định thử nghiệm của giá trị Col tới hạn: ....................................................................................... 8

2.7

Thời gian tới hạn của nồng độ cơ chất ................................................................................................. 9

2.8


5.

Nồng độ sinh khối .............................................................................................................................. 20

6.

Nồng độ sản phẩm (Sự thu hồi sản phẩm)........................................................................................... 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................................................... 22

NHÓM 12

Page 2


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
DANH MỤC VIẾT TẮT
RRM : vòng / phút
Vvm : thể tích không khí trên một thể tích môi trường / phút;
DO : oxy hoà tan;
DCW : trọng lượng tế bào khô
Yp / s : năng suất của protease đối với cơ chất (U / g)
Yp / x : sự hình thành sản phẩm protease đối với sinh khối (U / mg DC)
Yx / s : Năng suất sinh khối đối với cơ chất (mg / g)
OTR: tốc độ cung cấp khí oxy.
KL: hệ số truyền khối trong pha lỏng.
a: diện tích bề mặt tiếp xúc trên một đơn vị thể tích bể phản ứng (m2/m3).
C*OL: nồng độ oxy bão hòa trong pha lỏng cân bằng với pha khí.
COL: nồng độ oxy trong pha lỏng tại thời điểm đo.

enzyme dựa trên da đã được coi là một phương pháp thay thế thân thiện môi trường với quá trình
hóa học thông thường .
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, để loại bỏ cay đắng không mong muốn trong pho mát chín
là một ví dụ về protease trong sản xuất hương vị trong thực phẩm .Protease cũng được sử dụng
để phục hồi các phần protein của động vật và cá mà nếu không sẽ bị lãng phí sau khi giết mổ.
Protease cũng được sử dụng trong điều trị da cá để sử dụng trong công nghiệp.
Trong ngành dược phẩm, nó được sử dụng để ngăn ngừa quá nhiều máu đóng băng và làm giảm
đông máu xu hướng tiểu cầu và hồng cầu. Proteases cũng được sử dụng trong sản xuất thuốc,
trong đó enzym có thể được sử dụng như một chất hỗ trợ tiêu hóa bởi tuyến tụy.
Trong các loại thuốc sinh học, protease giúp ngăn ngừa hoặc điều trị các bệnh thoát khỏi tác
dụng của thuốc truyền thống, chẳng hạn như ung thư hoặc các bệnh đa dạng phổ biến khác .
Một ứng dụng chính khác là xử lý nước thải, nơi các proteaza kiềm có thể hòa tan các protein
trong chất thải thông qua một quá trình nhiều bước để thu hồi các chất lỏng cô đặc có giá trị dinh
dưỡng cao đối với cá và gia súc .
Protein kiềm là một trong những nhóm enzym được nghiên cứu rộng rãi nhất vì nó được sử dụng
rộng rãi trong nhiều ứng dụng công nghiệp như thực phẩm, dược phẩm và da và hai phần ba
trong ngành công nghiệp tẩy rửa một mình. Protease vi khuẩn đang ngày càng trở nên quan trọng
hơn các hóa chất thông thường để tách peptide bởi vì chi phí sản xuất rẻ hơn và sử dụng các
nguồn tái tạo. Protease vi khuẩn có thể được tạo ra từ vi khuẩn, nấm và men bằng cách sử dụng
nhiều quá trình như lên men trạng thái rắn, lên men ngập. Các vi khuẩn của chi Bacillus là những
nhà sản xuất hoạt tính của các proteaza kiềm chế ngoài tế bào. Hiện tại, một lượng lớn các
proteaza kiềm có trong omercian có nguồn gốc từ các dòng Bacillus. Mặc dù sản xuất protease là
một tài sản cố hữu của tất cả các sinh vật, chỉ có những vi khuẩn tạo ra một lượng lớn.

NHÓM 12

Page 4


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

enzyme là 37 ° C. Nó có thể tồn tại dưới dạng bào tử để chống lại các môi trường khắc nghiệt,
hoặc trong trạng thái thực vật khi điều kiện tốt.

NHÓM 12

Page 5


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
Môi trƣờng phát triển tốt nhất của vi sinh vật:

1.2.

Lúa mì -1%
dextrose-0.2%
bột đậu nành-0.3%
peptone-0.2%
Chiết xuất thịt bò
Chiết xuất nấm men
NaCl
Bổ sung thêm cơ chất cảm ứng casein để vi sinh vật tăng khả năng sản xuất protease.
Chuẩn bị giống:

1.3.

Sử dụng chủng vi khuẩn, Bacillus licheniformis NCIM 2044 thu được từ Bộ sưu tập Quốc gia về
vi sinh vật công nghiệp (NCIM).
2.

Bể phản ứng:

2.2.

Thời gian tới hạn đối với oxi:

Nếu truyền khối diễn ra ở một vị trí riêng lẻ trong hệ thống tuần hoàn, Oxi được bổ sung bởi
nồng độ Cof (mol m-3) tại vị trí đó sẽ sẵn sàng cho VSV. Sau khi qua khỏi vị trí bổ sung này, tốc
NHÓM 12

Page 6


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
độ tiêu thụ là OU R (mol m-3 s-1). Nếu OU R được cho rằng duy trì đúng giờ, kéo theo Eq. (18.1)
thích hợp với tcro (s), thời gian tới hạn với Oxi:
2.3.

Bể khuấy trộn:

Đối với những bể khuấy truyền khối diễn ra chủ yếu trong vùng khuấy, đặc biệt với môi trường
bán rắn. Do đó đối với hệ thống lên men có khuấy trộn với một cách khuấy, nồng độ trong vùng
khuấy trộn, Cols (mol m-3) cao hơn bất cứ vị trí nào trong bể. Nếu truyền khối bên ngoài, thiếu
khuấy, từ đó vùng khuấy có thể xem như vị trí bổ sung Oxi và Cols là Cof như định nghĩa ở trên.
Nếu tcro được định nghĩa cơ bản trên Cols, Eq. (18.2) trở thành:

Nếu truyền khối oxi chỉ diễn ra trong vùng cánh khuấy và không có sự truyền khối ngoài vùng
này, từ đó môi trường ra khỏi vùng khuấy và bị cạn kiệt oxi ở một thời gian gần bằng với tcro.
Trong lên men có khuấy trộn, truyền khối bên ngoài vùng khuấy trộn khác 0, nó thật sự thấp hơn
nhiều so với trong vùng khuấy. Điều đó có nghĩa là sự hao hụt sẽ diễn ra ở một giá trị thời gian
gần với tcro. Vì vậy, thời gian tới hạn đối với Oxi nên được tính toán trong tiến trình thiết kế và
tối ưu hóa. Đối với mục đích này, nó phải liên quan đến các thông số thiết kế. Điều này có thể

tối ưu thì Cols nên ở giá trị thấp đến mức có thể hoặc hoàn toàn bằng 0. Hai nhu cầu này mâu
thuẫn với nhau và một gia trị tối ưu nên được tìm ra. Đối với mục tiêu này, Cols nên được biết
chính xác. Lý thuyết chỉ phỏng đoán thứ tự độ lớn của những giá trị.
2.4 Thang không khí
Eq. (18.2) có thể được sử dụng cho truyền oxi trong vùng riêng lẻ và dòng đầu vào. Sự lôi cuốn
không khí có thể được coi như một phản ứng khép kín gần như dòng đầu vào. Trong phần này,
sự hao hụt oxi cục bộ bởi vì sự chuyển hóa được trao đổi ở mục trước sẽ không xảy ra. Eq. (18.2)
có thể được dùng trong phần này của hệ thống lôi cuốn không khí bởi việc đưa thời gian lưu
thông qua ống cho nhập liệu
2.5 Cột bọt
Khái niệm của tcr như được định nghĩa bởi Eq. (18.2) không dùng cho cột bọt vì truyền khối diễn
ra trong toàn bộ cột. Như đối với sự hòa tan không khí, giới hạn truyền khối có thể xảy ra ở phần
trên của những cột cao.
2.6 Xác định thử nghiệm của giá trị Col tới hạn:
Những mục trước cho thấy ở quy mô lớn sự hao hụt oxi cục bộ có thể xảy ra dễ dàng. Việc tính
toán có thể được tạo ra cho các nồng độ Col tại đó tác động có thể trở nên quan trọng. Sự hòa trộn
và sự phân tán trong phản ứng thì quá phức tạp để tính toán chính xác những giá trị này. Do đó,
một phương pháp thử nghiệm sẽ được thảo luận ở đây tạo thông tin bổ sung.
Mục đích của hầu hết các bể lên men sinh học là sản phẩm vi sinh vật. Đối với việc này việc tiêu
thụ oxi và việc sản xuất sản phẩm bởi vi sinh vật phải là tối ưu. Bởi vậy, để kiểm tra sự tối ưu
sau lên men thực hiện đo lường 2 con số OUR và việc tạo sản phẩm được tính trung bình cho
toàn bể, sẽ giảm khi điều kiện không thích hợp, khi sự thiếu hụt oxi ở bất kì đâu trong bể xảy ra.
Từ nguồn nguyên liệu có sẵn, sự thiếu hụt oxi xuất hiện ở quy mô nhỏ, những phản ứng trộn lí
tưởng, việc sản xuất sản phẩm ở nồng độ oxi tới hạn theo khoảng cách penicillin bắt đầu giảm
xuống rất thấp,


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
Cho sinh trưởng cực đại µ=µmax , xảy ra suốt trường hợp đã được đưa rằng, Cs>>KsTrong
trường hợp Cs cao, không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, µmax thường thu được trong bình
phản ứng với hàng loạt cơ chất hiện diện và không có sự ức chế cơ chất trong quá trình lên
men .
Khi tăng trưởng µ
Tiết kiệm chi phí cho đầu tư thiết bị
Hạn chế nhiễm

Ta có thời gian nghĩ của mỗi mẻ là tnghĩ = 20h
Vì thời gian thu được lượng protease lớn nhất đối với bacillus này là 72h
=> ta có tmẻ= 72h
Ta có 330 ngày làm viêc ( đã trừ số ngày nghĩ và lễ )
Số mẻ cần nuôi cấy trog một năm là :

= 86 mẻ

Dựa theo khảo sát của (Production Of Alkaline Protease From Bacillus licheniformis (NCIM
2044) And Media Optimisation For Enhanced Enzyme Production) nồng độ cơ chất sử dụng để
tạo lượng enzym cao nhất là 20g/l
Vì vậy ta có St – S0 = 20g/l
Dựa theo khảo sát của (Production Of Alkaline Protease From Bacillus licheniformis (NCIM
2044) And Media Optimisation) ta chọn được hiệu suất tạo sinh khối hiệu quả nhất với Yx/s =
0.375 với điều kiện tốc độ quay của cánh khuấy là 200rpm2 và 3vvm là tốt nhất với mức năng
lượng nhỏ hơn so với các tóc độ khác giúp cho việc sản xuất kinh tế hơn.
NHÓM 12

Page 11


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
Để thu được lương enzym 200 tấn/năm ta cần lượng sinh khối sinh ra trong một năm là:
Xnăm =

= 1291989.664 g sinh khối


= 260 m3

 D = 5.76 m
Vậy đường kính của thiết bị là : 5.76
Ta có : H=2*D
 Chiều cao của thiết bị là : H = 2.5.76 = 11.52 m
Đường kính vách ngăn cách nhiệt lớp vỏ áo :
dvách = 10%*D = 0,1 * 5,76 = 0.576 m
Đường kính của cánh khuấy là :
d = 0,3*D = 0,3 * 5,76 = 1,73 m
Chiều cao cánh khuấy :
h =0,2 * d = 0,2 * 1,73 = 0,346 m
Với chiều cao bể là 18.6 m ta thiết kế bể có 2 cánh khuấy, do đó khoảng cách giữa cánh thứ nhất
với đáy bể và giữa 2 cánh là 1.5 lần đường kính cánh khuấy, nên:
NHÓM 12

Page 12


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
Khoảng cách giữa 2 cánh khuấy cần tính là:
1.5 x 1.73 = 2.6(m)
Kiểm soát nồng độ oxy
Công thức tính tốc độ truyền khối oxy trong pha lỏng: OTR = kL.a (C*OL – COL)
Xác định C*OL
Theo định luật Henry thì C*OL phụ thuộc vào áp suất riêng phần của oxy trong khí sử dùng và độ
hòa tan của oxy. Hay: C*OL = po.Ho
Áp suất riêng phần của oxy phụ thuộc vào loại khí sử dụng là khí quyển, khí oxy nguyên
chất,…để po cao thì ta có thể tăng hàm lượng oxy trong dòng khí vào.
Độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:

Theo kết quả khảo sat của bài báo (Production Of Alkaline Protease From Bacillus licheniformis
(NCIM 2044) And Media Optimisation For Enhanced Enzyme Production) thi c ông suất yêu
cầu ở 200 vòng / phút và 3 vvm. là 0.0229 thì giá trị kLa tương ứng là 62 h-1
Chọn COL= 0.6

C*OL => COL = 0.6 x 7.67 = 4.6 (mg/L)

Tốc độ truyền khối oxy:
OTR = kL.a (C*OL – COL) = 62

(7.67 – 4.6) = 190.34 (mg.L-1.h-1)

3.2.
Thiết kế bể phản ứng thực hiện quy trình nuôi cấy công nghiệp thu nhận enzyme
protease kiềm với năng suất 200 tấn/ năm.
 Chuẩn bị giống , cấy truyền , tăng sinh :
(1) Cho một lượng chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis vào trong 3mL môi trường nuôi
cấy sản xuất protease tôt nhất , ủ ở 37oC, 150rpm trong 24 giờ.
(2) Nhân giống cấp 1 cho vào 30ml môi trường, và lấy 10% (1) cấy vô trùng truyền và duy
trì ở 37º C, 150 vòng / phút trong 24h.
Nhân giống cấp 2 sản xuất 300mL, lấy 10% từ (2) được chuyển vô trùng và duy trì ở 37 o
C, 150 rpm trong 24 giờ.
 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy.
Theo khảo sát để đạt được hoạt độ enzym cao nhất tốt nhất là 172,425 U / ml ở môi trường có
chứa : Lúa mì -1%, dextrose-0.2%, bột đậu nành-0.3%, peptone-0.2% và ở pH 9 và nhiệt độ 37
ºC khi ở pH thấp hơn, hoạt tính của enzym ít hơn vì protease kiềm chỉ ổn định ở khoảng pH cao
hơn.
Để đạt được nồng độ enzyme protease cao cần phải có cơ chất cảm ứng là một protein là casein
với một lượng là 20g/l .
Dựa vào sự khảo sát khi tăng nồng độ casein đã có ảnh hưởng đáng kể đến năng suất protease

 Chọn các thiết bị điều chỉnh nhiệt độ và Ph cho bể phản ứng
Bốn vách ngăn cách đều nhau được thiết kế để ngăn cản sự hình thành dòng xoáy làm giảm hiệu
suất pha trộn. Chiều rộng của vách ngăn thường bằng 1/10 đường kính của thùng.
Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí (aerobic fermenter), thì một bộ phun lỗ đơn (single orifice
sparger) hoặc một bộ phun vòng được sử dụng để sục khí cho hệ lên men. Bộ phận phun được
đặt ở vị trí giữa cánh khuấy cuối cùng và đáy của vessel.
Độ pH trong hệ lên men có thể được duy trì bằng cách dùng dung dịch đệm hoặc bộ điều chỉnh
pH (pH controller).
Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt và làm lạnh tự động.

NHÓM 12

Page 15


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

Hình 2. Sơ đồ cấu tạo bể lên men theo mẻ

3.3.

Xét nghiệm hoạt tính Enzyme:

Hoạt tính protease được xác định bằng cách sử dụng phương pháp Yang và Huang. Hỗn hợp
phản ứng chứa 1,5ml casein trong dung dịch 0,1M carbonate Bicarbonate (pH 10,5), clorua canxi
0,5mL 5mM, dung dịch enzym 0,5mL được ủ trong 30 phút ở 40 o C. Sau khi ủ, 2 ml dung dịch
acid tricloroaxetic được thêm vào, ủ ở 30 o C trong 45 phút. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được ly
tâm ở 3000rpm trong 10 phút và thu được chất nổi trên mặt. Độ hấp thụ được đo tại 280nm.
Tyrosine đã được sử dụng như là một tiêu chuẩn (0-100 μg / mL).
1 Đơn vị hoạt động enzyme bằng 1μg tyrosine phát hành mỗi phút ở điều kiện khảo nghiệm.

có thể xảy ra chiều cao nhỏ hơn 50m. Kết hợp tất cả các hạn chê ở trên, OTR có thể tối đa lên
cho bình khuấy và 0.06 cho cột bọt nước. Như những giá trị kết hợp của cực trị, 0.05mol là hợp
lí nhất.Dù những tính toán thể hiện rằng truyền khối trong bình lên men là hạn chế. Điều này
chấp nhận sự hạn chế của sự lên men. Eq 2.6b có thể viết lại cho CH2O như cơ chất

NHÓM 12

Page 17


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
Fig 18.3 thể hiện giá trị OUR dựa trên giá trị sinh trưởng và mật độ tế bào. Mật độ tế bào là
trong 1 vùng hạn chế vì kích thước vật lí không xảy ra. Cả 2 mật độ tế bào thể hiện trong hình
18.3. Trên 1 giá trị chắc chắn cho giá trị mật độ tế bào cao hơn ở giá trị sinh trưởng thấp. Điều
này minh họa sáng tỏ rằng OTR là 1 tham số giới hạn, nó có thể được nói chung rằng truyền khối
oxi là xác định giới hạn cho lên men hiếu khí nhất.

3. Hạn chế độ nhớt.
Trong phần trước đó đã được thể hiện rằng độ nhớt lên men thấp là giới hạn bởi OTR tăng mật
độ tế bào và giá trị sinh trưởng. Fig 18.3 thể hiện giá trị OUR như tính toán từ cân bằng và động
lực như nhau với Cx và µ biến đổi. Tuy nhiên,số liệu kotA và OUR trong hình chỉ giữ cho đọ
nhớt lên men, cho nấm men và vi khuẩn.
4. Hạn chế nhiệt độ, holdup, bọt.
Nguồn nhiệt độ sản xuất là tiêu thụ oxi và tiêu thụ năng lượng khuấy. Giá trị hợp lý như ướt tính
trong phần 18.2.2 và OUR= 0.05 mol m-3s-1 và Ps/V=2000 Wm-3 áp dụng công thức 13.3 hiệu
suất cho nhiệt sản xuất: ruH (W m-3)

NHÓM 12

Page 18

Như ở công thức 18.12, nồng độ sinh khối tối đa có thể đạt được liên quan đến sự hạn chế
chuyển hóa sinh khối. Gía ttrị này dưới giá trị mà sinh khối có thể được hạn chế. Nơi mà giới hạn
cơ học của kích cở không thể đạt tới đựơc.

Khoảng biến tthiên này khoảng 150-250 kg.m-3.
Các giá trị nồng độ sinh khối có thể được tính từ tổng sinh khối Mx, và thể tích canh trường (Vb)
trong bể phản ứng. Đối với nuôi cấy gián đoạn và nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất các Mx (t)
được tính toán bằng các phương trình cân bằng và năng suất như trong Chương 2 (xem Ví dụ
2.1). Vb có thể được tính từ trọng lượng nước dùng G(t) (kg) với sự cân bằng trọng lượng như
hình trong Chương 2 (Ví dụ 2.5). khi đó Cx (t) được tính bởi :

với ρb (kg m-3) là mật độ nước dùng. Đối với nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất trọng lượng
gần như sẽ giảm theo thời gian, chủ yếu là do các thành phần cơ chất bổ sung vào,có nghĩa là Cx,
sẽ tăng lên đến một mức độ thấp hơn so với Mx, nuôi cấy gán đoạn khi các thành phần cơ chất
vắng mặt , chỉ để lại O2, CO2 và bay hơi. Ở đây trọng lượng thường sẽ giảm dần theo thời gian,
dẫn đến Cx tăng nhanh hơn ,.
6. Nồng độ sản phẩm (Sự thu hồi sản phẩm)
Nồng độ sản phẩm là một yếu tố rất quan trọng của quá trình thu hồi. Một số đơn vị hoạt động
nhỏ, đặc biệt trong tách và cô đặc, là "phụ thuộc khối lượng," có nghĩa là năng suất độc lập với
nồng độ sản phẩm. Điều này làm cho chi phí tỉ lệ nghịch với nồng độ đó.
Nồng độ cho một mẻ nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất được cho bởi sau phương trình;
NHÓM 12

Page 20


KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

Phương trình này cho thấy lên men hàng loạt chỉ thích hợp đối với sản xuất cho những ứng dụng
mà tại đó ,giá trị Cx lớn cho toàn bộ quá trình lên men. Đối với hầu hết các quá trình lên men đợt

4. Adinarayana K, Ellaiah P. Investigations on alkaline protease production with B subtilis PE11 immobilised in calcium alginate gel beads. Process Biochemistry, 2004, 39, 1331-1339.
5. Mala B. Rao, Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge and Vasanti V. Deshpande, Molecular
and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases, Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 1998, 62 (3), 597–635.
6. Kumar D., Savitri, Thakur N., Verma R. and Bhalla T. C., Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology, 2008, 3,
661-672
7. Masse F. W. J. L., Van Tilburg R., The benefit
8.

9.

10.
11.

of detergent enzymes under changing
washing conditions, Jornal of American Oil Chemical Society, 1983, 60, 1672–75.
Singh L., Devi Y. and Devi S., Enzymological characterization of pineapple extract for
potential application in oak tasar (Antheraea proylei J.) silk cocoon cooking and reeling,
Electronic Journal of Biotechnology, 2003, 615, 12.
Rinsey Johnny V.A. and Karpagam Chinnammal S., Degumming Of Silk Using Protease
Enzyme from Bacillus Species, International Journal of Science and Nature, 2012, 3 (1), 5159.
Arunachalam C. and Saritha K., Protease enzyme: an eco-friendly alternative for leather
industry, Indian Journal of Science and Technology, 2009, 2 (12), 29-32.
Dayanandana A., Kanagarajb J., Lesley Sounderraja, Govindarajua R., Suseela Rajkumar
G., Application of an alkaline protease in leather processing: an ecofriendly approach,
Journal of Cleaner Production, 2003, 11 (5), 533–536.

12. Gupta R., Beg Q. K., Lorenz P., Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and