TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi trường

Tiểu luận:
TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT PROTEASE
KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIC VỚI CÔNG SUẤT (NHÀ
MÁY) 200 TẤN/NĂM

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai
Nhóm thực hiện: 01

Huỳnh Thị Thu Hà

2008140063

Lê Thị Khánh Hồng

2008140097

Nguyễn Hồng Đào

2008140037

Huỳnh Thị Quế Anh 2008140008

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2017


Mục lục
Chương 1
1.1.


Chức năng: .................................................................................... 5

1.3.

Giới thiệu chung về nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật ........ 6

1.3.1.

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme ....................... 6

1.3.2.

Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme bằng phương pháp nuôi cấy

chìm:

7

Chương 2

PHÂN TÍCH VÀ LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ........................... 10

2.1.

Nguyên liệu ........................................................................................ 10

2.2.

Quá trình lên men ............................................................................... 10

1.1.

TỔNG QUAN

Giới thiệu chung về Bacillus licheniformic

1.1.1.

Hệ thống phân loại:

Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: B. licheniformis
Bacillus licheniformic là vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt. Nhiệt độ
tăng trưởng tối ưu khoảng 30°C, tuy nhiên nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn
nhiều. Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là 37 °C. Trong điều kiện môi trường
khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt trong đất, nó có khả năng tạo bào tử.
Những bào tử này là khá chịu nhiệt, lạnh, bức xạ, và các áp lực môi trường khác.
Dưới những điều kiện tốt, các bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn. Vì vậy
người ta sử dụng nó để sản xuất các enzym, kháng sinh, và các chất chuyển hóa
nhỏ trong công nghiệp.

2


Vi khuẩn Bacillus licheniformic


Giới thiệu về enzyme protease kiềm

1.2.1.

Giới thiệu protease

Proteases (E.C.3.4.21.14) là những enzyme phá vỡ liên kết peptit giữa các axit
amin của protein. Chúng còn được gọi là enzyme proteolytic. Điều rất quan trọng
trong việc tiêu hóa là các enzyme phân hủy các protein phức tạp thành các axit
amin đơn giản hơn.
1.2.2.

Phân loại protease

Proteases có 6 nhóm, protease serine, protease threonine, Protease cysteine,
protease aspartate, và các kỹ thuật tổng hợp kim. Trong vi khuẩn, enzym protease
được sản xuất chủ yếu là Bacillus licheniformic, B.horikoshii, B.sphaericus, B.
furmis, B. alcalophilus, B. Subtilis
1.2.3.

Nguồn gốc

Protein kiềm được sản xuất bởi một loạt các vi sinh vật bao gồm vi khuẩn,
nấm mốc và nấm men, actinomycetes vv
Protease từ vi khuẩn đang ngày càng trở nên quan trọng hơn so với các hóa
chất thông thường để tách peptide bởi vì chi phí sản xuất rẻ hơn và sử dụng các
4





Một ứng dụng chính khác là xử lý nước thải, nơi các proteaza kiềm có thể hòa
tan các protein trong chất thải thông qua một quá trình nhiều bước để thu hồi các
chất lỏng cô đặc có giá trị dinh dưỡng cao cho cá và gia súc.
1.3.

Giới thiệu chung về nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme

1.3.1.

Thành phần môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố quyết
định ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật cũng như khả năng sinh tổng
hợp enzyme.
Để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu cho sụ sinh trưởng của vi sinh vật
và sinh tổng hợp enzyme trong môi trường cần có các chất chứa C, H, O, N và các
chất vô cơ khác như Mn, Ca, P, S, Fe, K và một số chất khác.
Nguồn C là các hợp chất hữu cơ, trước hết là gluxit. Khi sử dụng các đường
làm nguồn C cần chú ý đến một số đường có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp một
số enzyme thủy phân như: đường glucose…, ngoài gluxit cũng có thể dùng có thể
dùng các nguồn C khác như mỡ, dầu, acid hữu cơ, rượu, trong đó acid lactic được
vi sinh vật hấp thụ dẽ dàng hơn cả chúng có trong nước chiết ngô.
Nguồn N: có thể là hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể là
những nuyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc…
Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích tăng trưởng.
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật. Ion Mg2+ có khả
năng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. Nuôi cấy
thu nhận enzyme bằng phương pháp bề mặt. Là phương pháp tạo môi trường cho
vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc.

 Hiện đại, dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản
xuất.
 Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh
tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các
điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện
vệ sinh, vô trùng.
7


Nhược điểm:
 Do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi
enzyme sẽ có giá thành cao.
 Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các
khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác
nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy.
 Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm
hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất lớn.
Có 3 hình thức lên men chìm áp dụng trong nuôi cấy vi sinh vật là: nuôi cấy
gián đoạn , nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất và nuôi cấy liên tục.
Lên men gián đoạn (Batch culture): Vi sinh vật được nuôi cố định trong bình
lên men với một thể tích môi trường xác định, nguyên liệu và dinh dưỡng được
cho vào bể phản ứng ngay từ đâu và không bổ sung thêm nữa, vi sinh vật phát
triển theo giai đoạn và tạo ra các sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta tiến hành
các công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm. Phương pháp lên men chu kỳ được
ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như các loại enzyme, amino acid,
các chất kháng sinh,...
Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (Feed - batch culture): Để năng cao năng
suất của một mẽ lên men, người ta tiến hành bổ sung thêm cơ chất vào trong quá
trình lên men:
 Bổ sung từ từ các chất dinh dưỡng làm tăng thể tích dịch nuôi cấy.

mà còn phải dễ kiếm, chi phí thu mua và chế biến thấp, bên cạnh đó vẫn cho được
năng suất cao và ổn định.
2.2.

Quá trình lên men
Sản xuất protease Bacillus licheniformic NCIM-2042 được mua từ NCL, Pune,

Ấn Độ. Các vi sinh vật được nuôi cấy trên các chất dinh dưỡng thạch nghiêng agar
ở 35 ± 2 ◦C và pH 7,5
Sản xuất enzyme protease kiềm từ Bacillus licheniformic theo phương pháp
nuôi cấy gián đoạn theo mẽ với thời gian 72 giờ một mẻ. Trong phương pháp nuôi
cấy gián đoạn, vi sinh vật sinh trưởng đến khi thành phần chủ yếu của môi trường
dinh dưỡng bị cạn kiệt. Khi đó mật độ vi sinh vật chuyển từ pha lũy thừa sang pha
cân bằng. Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của đều kiện nuôi, sự giảm
chất dinh dưỡng và tăng khối lượng tế bào cũng thay đổi.
Lên men gián đoạn theo mẻ có ưu điểm là tương đối đơn giản và tiết kiệm chi
phí cho đầu tư thiết bị, hạn chế vấn đề bị nhiễm trong quá trình lên men, dễ xử lý
khi bị tạp nhiễm, có thể phát triển được quy mô lớn,…

10


Chương 3

CÂN BẰNG VẬT CHẤT

Nhà máy sản xuất protease kiềm với công suất 200 tấn/năm.
Thời gian nuôi cấy là 72h, ở 35oC, pH = 7.5 (Potumarthi. et al., 2006)
Thời gian sản xuất trong năm: 1 năm 365 ngày
 Thời gian bảo trì vệ sinh máy móc, thời gian nghỉ các ngày lễ: 35 ngày


0.3

Peptone

0.2

Cám lúa mì chứa khoảng 15.4% là protein. (Kew M. Chee. et al., 2005)
Khối lượng cám lúa mì trong 1 lit môi trường là 100g
Nồng độ protein ban đầu: S0 = 0.154*100 = 15.4 g/l
Nồng độ protein lúc sau: S = S0*(100 – 95)% = 15.4*0.05 = 0.77 g/l.
Ta có: YE/X =

, với (X-X0): lượng sinh khối tạo thành (g/l)
(X-X0) =

=

= 1.389 g/l

Hiệu suất tạo thành sinh khối trên một đơn vị cơ chất (g/g):
YX/S =

=

= 0.096 g/g

Lượng sinh khối ban đầu:
X0 =


O:

+ 2b = 0.5 + 2c + d

N: a = 0.2
Cân bằng điện tích: a = e = 0.2
=> a = 0.2 ; b = 7.5 , c = 7.55, d = 7.95 , e = 0.2 ,
=> Phương trình cân bằng vật chất có dạng:
1.425C6H12O6 + 0.2NH4+ + 7.5O2  CH1,8O0,5N0,2 + 7.55CO2 + 7.95H2O +
0.2H+
Lượng oxi tối thiểu cần cung cấp cho canh trường để đạt được nồng độ 4.63
g/l là:
[O2] =

= 45.17 g/l

- Lượng nitơ cần cung cấp cho canh trường để đạt được nồng độ 4.63 g/l là:
[N] =

= 1.05 g/l

- Khối lượng enzyme tinh đưa vào thiết bị Sấy:

13


m = 1818.18*

= 1913.87 (kg/mẻ)


4.1.

TÍNH TOÁN THIẾT BỊ

Thiết bị lên men

Hệ thống bể lên men cánh khuấy
Tốc độ sinh trưởng cực đại: μmax = 0.005 h-1.
- Hiệu suất tạo thành sinh khối trên một đơn vị cơ chất: YX/S = 0.096 (g/g) có
thời gian lên men t = 72h
- Xt = 4.63 (g/l)
- Lượng sinh khối/mẻ = V * Xt = 14.3*4.63 = 66.21 (kg/mẻ)
15


4.2.

Tính thể tích, đường kính và chiều cao thiết bị
- Thể tích canh trường lên men chiếm 2/3 thể tích thiết bị lên men
Vbể = * Vlên men = * 14.3 = 21.45 m3
=> Vbể = 22 m3
- Gọi:
Đường kính bể lên men: Dbể (m)
Chiều cao thiết bị : Hbể (m)
- Tỉ lệ chiều cao thiết bị và đường kính thiết bị thường là 2/1 hoặc 3/1 tức là
Hbể = 2Dbể hoặc Hbể = 3Dbể. Chọn Hbể = 2Dbể ta có
Vbể = Hbể*(
=> D2bể =

=

Tính toán kiểm soát nồng độ Oxy:
- Hệ số cung cấp khí tính theo công suất của cánh khuấy có dạng:

Với:
: Hệ số tốc độ truyền khối của Oxy trong pha lỏng (h-1, s-1)
a: Diện tích bề mặt riêng của pha khí (m2/m3)
: Nồng độ oxy bảo hòa trong pha lỏng (Độ hòa tan của Oxy) (mol/m3)
: Nồng độ oxy trong pha lỏng (mol/m3)
- Tốc độ cung cấp khí phụ thuộc vào

có mối quan hệ theo công thức sau:

17


= 2.10-3

0.7

*

(Bioprocess scale up, 2013)

Với:
P: Công suất cánh khuấy (W)
NP:Tốc độ cánh khuấy (= 200 rpm) (Potumarthi. et al., 2006)
vs: Tốc độ thông khí trên bề mặt 0.012 m/s (Oscara, et al., 2007)
Ta có:

Với:

Theo phương trình cân bằng vật chất, ta có:
YX/O =

= 0.1025g sinh khối/ gam O2

=> OUR = 4.63*

= 0.226 gam O2/ h

So sánh OTR = 144.3 g O2/ h > OUR = 0.226 g O2/h nên hệ thống cung cấp
khí phù hợp với bể phản ứng và thể tích lên men.
Kết luận:
Thiết bị lên men có đường kính: Dbể = 2.41 m và chiều cao: Hbể = 4.82m.
Lựa chọn trục khuấy gồm 3 bộ cánh cánh khuấy tuabin, có đường kính và
chiều cao lần lượt là: 0.723m và 0.15m; khoảng cách giữa cánh khuấy cuối cùng
với đáy thùng là 0.803m, và khoảng cách mỗi cánh khuấy cách nhau 3.0125m.

19


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Potumarthi, R., Ch, S., & Jetty, A. (2007). Alkaline protease production
by submerged fermentation in stirred tank reactor using Bacillus
licheniformic NCIM-2042: effect of aeration and agitation regimes.
Biochemical Engineering Journal, 34(2), 185-192.
[2] Sathyavrathan, P., & Kavitha, M. (2013). Production of Alkaline
Protease from Bacillus licheniformic (NCIM 2044) and Media
Optimisation for Enhanced Enzyme Production. Int J Chem Tech Res,
5(1), 550-553.
[3] Bhunia, B., Basak, B., & Dey, A. (2012). A review on production of