TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===o0o===

PHAN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài
“Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Curcumin của màng
Cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trƣờng”, với lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Nguyễn Xuân Thành - Ngƣời đã hƣớng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Viện Nghiên cứu
khoa học và Ứng dụng - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, các thầy cô và
các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý ngƣời và động
vật, khoa Sinh -KTNN trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt


CNM

: Cao nấm men

CV

: Cellulose vi khuẩn

MT1

: Môi trƣờng 1

MT2

: Môi trƣờng 2

MT3

: Môi trƣờng 3

CNM

: Cao nấm men

OD

: Optical density

UV – vis

2.2.3. Chuẩn bị bộ đệm .......................................................................................................... 20
2.2.4. Chế tạo màng CVK nạp CUR .............................................................................. 21
2.2.5. Xác định lượng CUR nạp vào màng CVK .................................................... 21
2.2.6. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK nạp thuốc CUR 21
2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................................. 23
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 24


3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng CVK từ các môi trƣờng khác nhau ..... 24
3.1.1. Thu màng CVK từ các môi trường lên men .................................................. 24
3.1.2. Quá trình xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc .............................. 25
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK thích hợp .... 25
3.1.4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ............................................................ 27
3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK ............................................. 28
3.2.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men ........................................ 28
3.2.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già ........................................ 29
3.2.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo .......................................... 31
3.3. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK lên men từ các môi
trƣờng khác nhau ............................................................................................. 32
3.4. Đánh giá động dƣợc học giải phóng của thuốc CUR từ màng CVK ....... 33
Kết luận ........................................................................................................... 38
Kiến nghị ......................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 39


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK ............................ 17
Bảng 2.2. Mật độ quang của dung dịch CUR ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau (n = 3) ..................................................................................................... 19
Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS ...................................................................... 20

Hình 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng nƣớc vo gạo với độ dày 0.3cm và
1cm .................................................................................................................. 32
Sơ đồ 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK ....................................................... 18


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tƣơng thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật
liệu sinh học có những đặc tính trên đƣợc chú ý là Cellulose. Vật liệu này
vƣợt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [15]. Trong đó,
Cellulose vi khuẩn hay màng sinh học (CVK) là đối tƣợng của nhiều nghiên
cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nƣớc cũng nhƣ nƣớc ngoài. Đây là
một loại nguyên liệu mới, đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ thực
phẩm, y học, mỹ phẩm, ...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK đƣợc
tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công
nghiệp. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các
loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra, CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, ổn
định về kích thƣớc và hƣớng. CVK còn là một mạng polyme sinh học có khả
năng giữ nƣớc rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu đƣợc một thể tích
đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao) [5].
Ngoài ra, màng CVK còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn
cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV, có tiềm
năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm
thấu qua da, qua đƣờng miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh
học khác [5, 6, 9, 28],…
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng CVK
làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc có

thu vào mức độ huyết tƣơng và mô thấp của CUR là do kém hấp thu, chuyển
hóa nhanh chóng, và loại bỏ hệ thống nhanh chóng. Để cải thiện sinh khả
dụng của CUR, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc thực hiện [8].

2


Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của CUR trong quá
trình điều trị, xét thấy đây là hƣớng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lý do
chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc
Curcumin của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trƣờng.”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi và thu sản phẩm màng CVK từ chủng
Acetobacter xylinum.
- Thiết kế các hệ thống gồm CVK đƣợc nạp thuốc từ một số môi trƣờng
và so sánh khả năng giải phóng thuốc CUR của các hệ thống giải phóng kéo
dài trong các môi trƣờng pH khác nhau.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lý màng CVK.
- Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp CUR.
- Khảo sát so sánh khả năng giải phóng của các màng CVK - CUR in vitro.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trƣờng nƣớc dừa già,
nƣớc vo gạo và môi trƣờng chuẩn (cao nấm men), thuốc CUR tinh khiết 95%.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng
thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật
khoa Sinh - KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Viện Nghiên cứu
khoa học và Ứng dụng -trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.

Theo khóa phân loại của Bergey [20], A. xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ : Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang
khoảng 0.6 – 0.8 µm, dài khoảng 2 - 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhƣng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trƣờng nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [5].
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dƣơng tính, không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer, không tạo sắc
tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid,
chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau và tùy thuộc
vào chủng mà nguồn đƣờng nào đƣợc sử dụng tốt nhất.

5


Nhiệt độ tối ƣu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng
trƣởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ƣu để sản xuất cellulose là 5.5 [5, 20].
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Màng CVK cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1,4 - glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của CVK giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc
đại thể [13, 28].

1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
Các vị trí tổng hợp cellulose của A. xylinum là những lỗ nằm trên bề mặt
tế bào, có đƣờng kính 3.5nm sắp xếp song song trên đƣờng thẳng trục dọc của
vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10nm chứa các enzym có chức năng
trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến
các chức năng khác [5].
A. xylinum hấp thu đƣờng glucose vào trong tế bào, kết hợp với một
acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này đƣợc tiết
ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo
cellulose. Các sợi siêu nhỏ 1.5nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi,
sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ. Các bó sợi này sẽ đƣợc phun vào
môi trƣờng nuôi cấy [5].
1.1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn
dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng [5].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose
cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol,
acetate. Việc sử dụng các loại đƣờng cũng nhƣ nồng độ các loại đƣờng trong
môi trƣờng còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [5].

7


Nhu cầu sử dụng đƣơng ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng
các sản phẩm: rỉ đƣờng, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và pho
mát, nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo, cao nấm men và nƣớc mía... để làm nguyên

nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite. Nhƣ vậy, trong
lĩnh vực này cần tiếp tục đƣợc tiến hành nghiên cứu.
Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng CVK làm hệ
thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho
thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của thuốc ở dạng thông
thƣờng. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô CVK
thu đƣợc sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng
khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi
đơn vị diện tích bề mặt đã đƣợc tìm thấy là 0.116 kg/cm2, và tác dụng của
thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S. aureus và B. Subtilis
[31]. Nghiên cứu khác cho thấy việc sử dụng nanocomposites bạc với CVK
đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [21].
Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng CVK qua da đã đƣợc
nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và
không đƣợc chiếu xạ. CVK không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh
hơn so với ảnh hƣởng của CVK chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy
màng CVK không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho
giải phóng thuốc qua màng [6]. Việc sử dụng màng CVK cho việc thẩm thấu
qua da của nhiều thuốc, cụ thể là ibuprophen [33], caffeine [24], diclofenac
[25] và sulfadiazine bạc [16] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu
cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng CVK giúp màng linh động hơn và

9


tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả các loại thuốc trên đã đƣợc thử
nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua da [17] và so sánh với cách thức thông
thƣờng. Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ƣu mỡ thấm qua màng CVK cao
hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400;

Hình 1.1. Cấu trúc CUR 1,7 - bis (4 - hydroxy - 3 - metoxyphenyl) - 1,6 heptadien - 3,5 - dione
+ Hiện tại ngƣời ta tìm thấy CUR tồn tại ở 4 dạng hợp chất:
- CUR chính thức (còn gọi là CUR I) chiếm 60% tổng lƣợng CUR.
- Demethoxycurcumin (CUR II) chiếm 24% tổng lƣợng CUR.
- Bis - demethoxycurcumin (CUR III) chiếm 14% tổng lƣợng CUR.
- Và một hợp chất mới xuất hiện là cyclocurcumin chiếm khoảng 1%
[1, 2, 3, 8].
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
* Nguồn gốc:
CUR là hoạt chất đƣợc chiết xuất từ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., họ
gừng Zingiberaceae, chiếm 0.3% khối lƣợng khô của cây Nghệ vàng [3, 7, 18].
Thành phần hóa học của nghệ gồm: nhóm chất màu curcuminoid, tinh
dầu và các hợp chất khác [3].
* Tính chất:
+ Tinh thể nâu đỏ, ánh tím [18].
+ Nhiệt độ nóng chảy: 183ᴼC [1, 2].
+ Độ tan: không tan trong nƣớc, CUR tan trong ethanol [14].

11


+ Độ hấp thụ: 427nm [22].
+ CUR có thể tồn tại dƣới các dạng đồng phân tƣơng hỗ enol hoặc keto.
Đồng phân xeto tồn tại ở dạng rắn còn đồng phân enol tồn tại trong dung
dịch, dạng keto chiếm ƣu thế trong các giải pháp có tính axit và trung tính và
dạng enol ổn định trong môi trƣờng kiềm [14, 32].
1.2.1.3. Dược động học và tác dụng
 Dược động học
Sự hấp thu, sinh khả dụng, nghiên cứu sự trao đổi chất, và loại bỏ các
chất CUR có, không may, chỉ hiển thị kém hấp thu, chuyển hóa nhanh chóng,

mạch bằng cách làm giảm sự hình thành của máu làm các khối [22].
CUR ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm
loét dạ dày và đã đƣợc liên kết với ung thƣ dạ dày. CUR có thể gắn với các
kim loại nặng nhƣ cadmium và chì, do đó làm giảm độc tính của các kim loại
nặng. Thuộc tính này của CUR giải thích hành động bảo vệ của nó đến não.
CUR hoạt động nhƣ một chất ức chế cho cyclooxygenase, 5 - lipoxygenase và
glutathione S - transferase [14].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR
1.2.2.1. Trên thế giới
Các tài liệu khoa học trong 20 năm qua trên curcumin cho thấy chất
curcumin có thể là một ứng cử viên mong muốn trong phòng ngừa và điều trị
bệnh ung thƣ. Số liệu hiện tại (theo cơ sở dữ liệu SciFinder, ngày 23 tháng 8
năm 2011) cho thấy tổng cộng có 12903 lƣợt truy cập vào "curcumin". Trong
số đó, 60 tài liệu tham khảo là các thử nghiệm lâm sàng, 1094 tài liệu tham
khảo trong một hình thức xem xét và tham khảo 1515 trên các ứng dụng bằng
sáng chế. Có tổng cộng 56 thử nghiệm lâm sàng (giai đoạn I và giai đoạn II)
trên CUR đƣợc liệt kê trên trang web của Viện y tế Quốc gia Hoa Kỳ. Trong số
đó, 16 thử nghiệm đã đƣợc hoàn thành, ba thử nghiệm đã đƣợc chấm dứt, một
ngƣời bị thu hồi và phần còn lại của các nghiên cứu đang đƣợc thực hiện [26].

13


Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuswandi và các cộng sự [10] về
CUR /CV trong việc phát hiện sự hƣ hỏng của tôm. Công trình này sử dụng
thuốc nhuộm tự nhiên của chất CUR nhƣ chất cảm biến để phát hiện các biến
động vô cơ và hữu cơ đƣợc sản xuất trong quá trình tăng trƣởng của vi khuẩn
trong mẫu tôm. CUR đƣợc sử dụng nhƣ là thuốc thử cảm biến tự nhiên, là cố
định trên CVK sử dụng hấp thụ nhƣ một phƣơng pháp đơn giản cho phép
khối lƣợng sản xuất của bộ cảm biến chi phí thấp. Nhƣ vậy, tất cả các vật liệu



Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.Vật liệu nghiên cứu
- Thuốc CUR (95%) có nguồn gốc từ Ấn Độ. - Etanol 96º có nguồn gốc
Việt Nam.
- Màng CV (99% hàm lƣợng nƣớc) đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2) lên
men từ nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo, cao nấm men.
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius - Thụy Sỹ); Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA; Buồng cấy
vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA Đức); Máy rung siêu âm TCP 280; Tủ lạnh Daewoo, Tủ lạnh sâu và nhiều
dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK: Glucose,
Pepton, KH2PO4, (NH4)2SO4, nƣớc dừa, nƣớc vo gạo, cao nấm men, axit
acetic, HCl, NaOH,..đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum với các nguyên liệu có sẵn.
+ Thu sản phẩm CVK từ dịch nuôi cấy và quá trình xử lý.
+ Chế tạo màng sinh học nạp thuốc CUR.
+ Khảo sát và so sánh khả năng giải phóng thuốc từ các màng CVK CUR in vitro ở các môi trƣờng pH khác nhau.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị màng CVK
- A. xylinum đƣợc nuôi cấy để tạo màng CVK trong môi trƣờng cải biên
từ môi trƣờng chuẩn Hestrin - Schramm [19] đƣợc trình bày trong bảng 2.1.

16




0.3g

0.5g

0.5g

Amoni sulfat
Cao nấm men

5g

Acid citric

1.5g

Nƣớc cất 2 lần

1000ml

Nƣớc dừa già

1000ml

Nƣớc vo gạo

1000ml

- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng
chƣa có acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa.