TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

TRƢƠNG THỊ PHƢƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CURCUMIN CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Xuân Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc Curcumin của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già”
Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Do bước đầu đi vào thực tế sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến
thức của em còn hạn chế. Do vậy không tránh khỏi những thiếu xót trong quá
trình thực hiện, em rất mong nhận được sự góp ý quý báu của quý thầy cô và

4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ........................................................................................... 3
5.1 Ý nghĩa khoa học: ............................................................................................................ 3
5.2 Ý nghĩa thực tiễn: ............................................................................................................ 4
NỘI DUNG ........................................................................................................................... 5
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 5
1.1 Tổng quan về Cellulose vi khuẩn ..................................................................................... 5
1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra Cellulose vi khuẩn ....................................................................... 5
1.1.2 Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm thu màng Cellulose vi khuẩn .......................... 5
1.1.3 Cấu trúc của màng Cellulose vi khuẩn ......................................................................... 7
1.1.4 Đặc tính của màng Cellulose vi khuẩn ......................................................................... 7
1.1.5 Ứng dụng của màng Cellulose vi khuẩn ....................................................................... 8
1.2 Tổng quan về curcumin ................................................................................................... 9
1.2.1 Sơ lược về thuốc curcumin ........................................................................................... 9
1.2.2 Dược chất .................................................................................................................... 11
1.2.3 Sinh khả dụng của curcumin ....................................................................................... 13
1.2.4 Tính chất lí hóa của curcumin ..................................................................................... 13
1.2.5 Rủi do, tác dụng phụ của curcumin ............................................................................ 14
1.2.6 Một số công trình nghiên cứu về curcumin ................................................................ 14
1.2.7 Một số chế phẩm curcumin trên thị trường ................................................................ 16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 17
2.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 17
2.1.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 17
2.1.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ..................................................................... 17
2.1 .3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng Cellulose vi khuẩn .............. 17
2.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 18


2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 19
2.3.1 Tạo màng Cellulose vi khuẩn từ môi trường nước dừa già. ....................................... 19

Optical density

OD


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già. .................................................................... 6
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của curcumin. .............. 14
Bảng 2.1. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng Cellulose vi
khuẩn....................................................................................................................................18

Bảng 2.2. Thành phần môi trường tạo màng Cellulose vi khuẩn. ...................... 19
Bảng 2.3. Bảng nồng độ curcumin giá trị OD247nm (n = 3). ............................. 22
Bảng 2.4. Môi trường đệm PBS .................................................................................. 24
Bảng 3.1. Khối lượng thuốc được nạp vào màng Cellulose vi khuẩn ............... 33
Bảng 3.2. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong các môi
trường pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau ................................................. 34
Bảng 3.3. Tỉ lệ phần trăm giải phóng thuốc curcumin của các màng ở các môi
trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n =
3)........................................................................................................................................36
Bảng 3.4. Hệ số tương quan bình phương R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và
trị số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau .......................... 39


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của Cellulose vi khuẩn. .................................. 7
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của curcumin................................................................... 9
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 18

toàn diện là curcumin. Những năm gần đây, curcumin nổi lên như một hoạt
chất của thời đại với số lượng trên 1000 nghiên cứu và trên 6000 bài báo viết
về tác dụng. Kết quả nghiên cứu khẳng định, curcumin là một trong những
tinh chất thiên nhiên tốt cho sức khỏe. Curcumin đã được các nhà khoa học
khẳng định hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính, nan y như:
ung thư, viêm loét dạ dày (curcumin có tác dụng diệt 65 chủng lâm sàng vi
khuẩn Helicobacte pylori, ức chế chất gây viêm COX2 [4], tăng tái tạo mạch
máu, chống thiếu máu cục bộ, tăng tiết chất nhày dạ dày. Thử nghiệm lâm
sàng cho rằng curcumin an toàn ngay cả ở liều cao (12g/ngày) ở người, tuy
nhiên sinh khả dụng kém.
Đây cũng là rào cản lớn khiến tinh chất nghệ curcumin chưa được ứng
dụng rộng rãi. Curcumin ít tan trong nước (độ tan 0,001%) [25] curcumin hòa
tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 - 10% curcumin
được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả
dụng thực tế của curcumin chỉ đạt 2 - 3% [17].
Hiện nay, có rất nhiều các nhà nghiên cứu về các vật liệu ứng dụng để
vận chuyển thuốc nhằm làm tăng sinh khả dụng của thuốc như chế tạo bao
phim pellet metoprolol succinat trên hệ thống bao tầng sôi tạo chế phẩm
phóng thích kéo dài, hay sử dụng vật liệu liposome làm vật liệu dẫn thuốc
cũng đem lại rất nhiều những hiệu quả nhất định.
Trong những năm gần đây, đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật
1


liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật liệu này vượt
trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [19]. Tuy nhiên, hình thái,
đặc tính và các lĩnh vực ứng dụng cụ thể phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc, tức
là "quá trình xây dựng" các loại cellulose.

5.2 Ý nghĩa thực tiễn:
+ Xây dựng được quy trình tạo màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi
trường nước dừa già.
+ Từ màng Cellulose vi khuẩn đã được tạo ra được dùng làm hệ thống
giải phóng thuốc.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

4


NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về Cellulose vi khuẩn
1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra Cellulose vi khuẩn
Cho đến nay, A. xylinum được đánh giá là vi khuẩn có khả năng tạo ra
màng Cellulose vi khuẩn tốt nhất. Loài vi khuẩn gram âm sống hiếu khi bắt
buộc, không sinh bào tử có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong. Có thể di động hoặc
không và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram của
chúng có thể bị thay đổi do tế bào già đi hoặc do môi trường nuôi cấy, sắp xếp
riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại hiếu khí bắt buộc nên
chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí,
có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy.
Trên môi trường rắn, sau khoảng 3 - 7 ngày nuôi cấy sẽ thu được khuẩn
lạc nhỏ nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, đục có
màu cà phê sữa, khô dần [3].
1.1.2 Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm thu màng Cellulose vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.


0,2

Selenium (^g/100g)

1

Carbonhydrat (%)

3,17

Vitamin C (mg/100g)

2,4

Đường(%)

2,16

Thiamin (mg/100g)

0,03

Riboflavin (mg/100g)

0,057

Niacin (mg/100g)

0,08


105

Kẽm (mg/100g)

0,1

3

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng
như 1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, ... Vì vậy, A.
xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trường này [13].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [3, 13].

6


1.1.3 Cấu trúc của màng Cellulose vi khuẩn
Màng Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của Cellulose vi khuẩn giống cellulose của thực vật (plant
cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [6].
Theo AJ.Brow (1886) [9], màng Cellulose vi khuẩn gồm nhiều sợi siêu
nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết hợp với nhau. Các
sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài
khoảng 100nm, rộng 3 - 8nm. Cấu trúc hóa học của màng Cellulose vi khuẩn
thể hiện ở hình 1.1:


Cellulose vi khuẩn để: tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong
điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da [3], ... Tính đến cuối năm
2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn
trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [20].
- Tại Việt Nam:
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [3] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế
và thu màng Cellulose vi khuẩn từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm
nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng
Cellulose vi khuẩn điều trị bỏng với 2 loại màng Cellulose vi khuẩn gồm cho
8


thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác
dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn.
Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.
1.2 Tổng quan về curcumin
1.2.1 Sơ lược về thuốc curcumin
Tên IUPAC: (1E, 6E) - 1,7 - bis (4 - hydroxy - 3 - metoxyphenyl) - 1,6
- heptadien - 3,5 - dion.
- Công thức phân tử: C21H20O6.
- Phân tử khối: 368,38 g/mol.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Curcumin

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của curcumin
- Curcumin là tinh thể màu nâu đỏ, là hoạt chất được chiết ra từ củ nghệ

vàng thuộc họ gừng. Hiện tại, người ta tìm thấy curcumin tồn tại ở 4 dạng hợp
chất [7]:
+ Curcumin là hợp chất chính chiếm 60%.

pylori, ức chế chất gây viêm COX2, tăng tái tạo mạch máu. Tăng tiết chất
nhày dạ dày.
Curcumin hủy diệt dung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy diệt
từng bước các tế bào ác tính. Chúng làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn
chặn việc hình thành các tế bào ung thư mới, trong khi đó các tế bào lành tính
không bị ảnh hưởng. Curcumin được coi là chất tiêu biểu nhất cho thế hệ mới
các chất chống ung thư, vừa hiệu quả, vừa an toàn và không gây tác dụng phụ.
Curcumin còn có khả năng loại bỏ các loại men gây ung thư như COX - 1,
COX - 2 có trong thức ăn, nước uống hàng ngày, vô hiệu hóa các gốc tự do
hình thành trong quá trình tự vệ của cơ thể, do bức xạ độc hại, các loại sốc
thần kinh, thể lực, các độc tố hóa học (dioxin, furan...), ...
Curcumin có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm
tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn
chặn béo phì, xóa bỏ tàn nhang, đồi mồi, trứng cá chống rụng tóc giúp mau
chóng mọc tóc, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, sức lực và cả
tuổi thọ...
- Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống oxy hóa điển

hình. Nó không chỉ điều trị đắc lực cho các bệnh ung thư, loét dạ dày, hành tá
tràng, đại tràng, yếu gan mật, viêm gan B, C, sơ gan cổ chướng, ... mà còn
điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả cao các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như
viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi cầu khớp, bệnh đa sơ cứng, bệnh cứng
bì, loãng xương, viêm cơ, vảy nến, ban đỏ hệ thống, đau hệ tiêu hóa, rối loạn
tuyến giáp, u máu, suy giảm trí nhớ, ... hỗ trợ điều trị bệnh Parkison, nhũn não
[14].
- Curcumin có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virut HP, viêm

gan B, C, ... rất cao.
- Curcumin ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là



proton hóa H4A+.
-

Ở pH 1 - 7 hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa H3A,

có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng.
-

pH > 7,5 màu dung dịch chuyển sang màu đỏ.Giá trị hằng số phân ly
13


pKa của 3 proton dạng acid của curcumin (dạng H2A- , HA-2 , A3-) được xác
định tương ứng là 7,8; 8,5 và 9,0. Nghiên cứu ở kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp
(HPLC) cho kết quả điện ly theo pH của curcumin được thể hiện như bảng
1.2:
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của curcumin
pH

Màu của dung dịch

Dạng ion tồn tại


103266 A2 ngày 30/5/2001 (Ib - 8), và tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano
curcumin dành cho mục đích y học được công bố vào năm 2005.
14


Những tác giả đầu tiên đã nghiên cứu trên thực nghiệm để chứng minh
tác dụng điều trị của curcumin đó là: tác dụng chống tăng đường huyết
(Srinivasan, M. 1972), tác dụng chống viêm (Srimal, R.C. 1973), tác dụng
chống oxy hóa (Sharma, O.P. 1976), tác dụng chống thấp khớp (Deodhar,S.D.
1980), tác dụng bảo vệ gan (Kiso, Y. 1983), tác dụng chống ung thư (Kuttun.
R. 1985), tác dụng ức chế tắc mạch (Srivastava, R. 1995), tác dụng phòng
nhồi máu cơ tim (Dikshit, M. 1995), tác dụng kháng khuẩn (Jordan, W.C.
1996), tác dụng bảo vệ thận (Venkatesan, N. 2000), tác dụng chống viêm loét
dạ dày (Ronita De, 2009) [11, 21, 22], ...
- Ở Việt Nam
Tại Việt Nam, rất nhiều các nhà khoa học tại các trung tâm nghiên cứu
lớn cũng đang tiến hành thử nghiệm để chế tạo vật liệu nano curcumin từ củ
nghệ vàng như Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam (Viện HLKHVCNVN), Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ
cao Thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Dược Hà Nội. Trong đó, nano
curcumin của viện hóa học là đề tài đầu tiên được ứng dụng công nghệ nano
vào bào chế các dược phẩm và thực phẩm chức năng, giúp phòng ngừa và
điều trị hiệu quả các bệnh mãn tính, nan y.
Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly, Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí
Minh đã nghiên cứu chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng và xây dựng bộ dữ
liệu chuẩn của curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu [1]. Hay
nhóm các nhà nghiên cứu Dương Thị Hồng Ánh, Phạm Văn Giang, Nguyễn
Trần Linh Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu
phân nano curcumin bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa
tốc độ cao [1].

cách sử dụng vi khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP
Hà Nội 2) lên men trong môi trường dinh dưỡng.
2.1.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích (Sartorius - Đức);
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Bình tam giác có chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh có chia

vạch, bình thủy tinh 500ml, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, thước, gạc vô trùng,
giấy lọc, giấy quỳ tím và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng Cellulose vi
khuẩn
Các vật liệu để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng
Cellulose vi khuẩn được trình bày ở bảng 2.1:

17