TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

PHẠM THỊ MONG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn
và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin
đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Cao Bá Cƣờng
(Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2).
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của
các thầy cô của Viện NCKH và ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô
trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo
cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4
1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose ............................... 4
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK .............................................. 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn............................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn ............................................. 4
1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn......................................................... 5
1.1.4. Ứng dụng của CVK............................................................................. 6
1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose................................................................ 8
1.2.1. Phân loại A. xylinum ........................................................................... 8
1.2.2. Đặc điểm hình thái của A. xylinum ..................................................... 8
1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum......................................................... 9
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum ................................................... 9
1.2.5. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum ......................................................... 9
2. Giới thiệu về thuốc berberin ................................................................... 11
2.1. Công thức ............................................................................................. 11
2.2. Tính chất............................................................................................... 12
2.3. Tác dụng dƣợc lý.................................................................................. 12
2.4. Tƣơng tác thuốc ................................................................................... 12
2.5. Chỉ định ................................................................................................ 13
2.6. Chống chỉ định ..................................................................................... 13
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................. 13


3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc ................................................................. 13
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 13
3.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 13
3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK ........................................................ 14
3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 14
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 16

CVK

Celulose vi khuẩn

OD

Mật độ quang phổ

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

NCKH và ƢD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK .......................................................................... 7
Bảng 1.2. Thành phần của nƣớc dừa già. ........................................................ 10
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK ............................................... 17
Bảng 2.2. Kết quả đo dƣờng chuẩn thuốc berberin ở bƣớc sóng 345nm
(n = 3)............................................................................................ 21
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch berberin 10% khi ngâm màng CVK
(n= 3) ............................................................................................. 28
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc berberin hấp thụ vào màng CVK (n = 3) .................. 29

trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế
bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm,
thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc cùng nhiều ứng dụng khác [28].
Gần đây, khả năng ứng dụng màng CVK không ngừng đƣợc nghiên cứu, cải
tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al.,2000). Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu
ứng dụng mới chỉ dừng lại bƣớc đầu nghiên cứu.
Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK đƣợc tạo nên từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi
trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum rất đa dạng nhƣ nƣớc dừa già, rỉ đƣờng,
nƣớc mía,… Trong đó nƣớc dừa già đƣợc coi là môi trƣờng kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum [7].

1


Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, khả
năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ,... Đồng thời CVK là một hàng rào cản
oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và
ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thƣớc và hƣớng, màng CVK còn
có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [27], [20],… Bên cạnh đó,
các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống hấp thu thuốc làm tăng sinh
khả dụng của thuốc [20].
Nƣớc ta thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa: nóng ẩm, mƣa nhiều nên vi
khuẩn, nấm mốc và kí sinh trùng rất dễ phát triển, cùng với điều kiện vệ sinh
an toàn thực phẩm cũng nhƣ vệ sinh môi trƣờng ở nhiều nơi còn khá thấp nên
dễ tạo thành tạo các bệnh nhƣ rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, đau mắt hột.
Berberin là thuốc thông thƣờng mọi ngƣời hay sử dụng khi có dấu hiệu tiêu

- Vật liệu nghiên cứu: màng CVK làm từ môi trƣờng nƣớc dừa già,
thuốc berberin.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm sinh lý ngƣời và động vật
khoa Sinh - KTNN - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; Viện NCKH và ƢD Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm
hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, tìm ra đƣợc khả năng hấp thụ thuốc
berberin của màng CVK.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: nếu thành công, đề tài định hƣớng khắc
phục đƣợc nhƣợc điểm berberin thông thƣờng nhƣ nâng cao tác dụng của
thuốc, rút ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí điều trị cho con ngƣời,…

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK
1.1.1. Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với
nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan đƣợc vi khuẩn tổng hợp
nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5nm [6, 23]. Đây là những
thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tƣợng
tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi,
những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 34nm, và chiều dài 130-177nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của
cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lƣới dày dặc,
đƣợc ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al.,

mịn, kích thƣớc ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nƣớc và hấp thụ nƣớc cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có
độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lƣợng nhẹ, tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose đƣợc tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản
xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bƣớc trung gian.
Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp đƣợc cellulose dƣới dạng màng mỏng hoặc
dƣới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
- Có thể kiểm soát đƣợc đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn
bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ
đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lƣợng phân tử cellulose.

5


1.1.4. Ứng dụng của CVK
Mặc dù bản chất hoá học của CVK tƣơng tự cellulose thực vật nhƣng
nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dƣới hoá chất và nhiệt
độ cao. Ngoài ra còn nhiều điểm ƣu việt nhƣ: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền
đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nƣớc và
hút nƣớc cao và một số điểm khác. Với những điểm ƣu việt này, CVK còn
đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: Trong công nghiệp giấy
màu CVK đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao, trong công
nghiệp môi trƣờng đã sử dụng màng CVK làm màng phân tách để xử lý nƣớc
và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998), dùng làm

Màng nhân tạo

Mỹ phẩm

Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh
bóng móng tay
Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Môi trƣờng

Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

Thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội
Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lƣu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác


mép khuẩn lạc nhẵn.

8


1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum
- Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.
- Phản ứng catalase dƣơng tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.
- Không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer.
- Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.
- Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.
- Không sinh sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum
Màng cellulose đƣợc sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự
phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.
- Cung cấp chất dinh dƣỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn [21].
- Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới
đƣợc bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào
gần ranh giới lỏng khí của môi trƣờng mới sản xuất cellulose [33].
- Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ
chất và bảo vệ vi khuẩn trƣớc những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.
- Vì độ nhớt và đặc tính ƣa nƣớc của lớp cellulose nên khả năng chống
chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi
sinh vật gây bệnh,…) trong môi trƣờng sống tăng lên.
- Sợi cellulose giúp chống ảnh hƣởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn
acetic đƣợc bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiểu
tia UV [21].
1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn

0.72

Mangan (mg/100g)

0.142

Chất béo toàn phần (%)

0.2

Selen (µg/100g)

1

Cacbohydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

2.4

Đƣờng (%)

2.16

Vitamin B1 (mg/100g)

0.03


0.032

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B9 (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

10


Nƣớc dừa già là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nƣớc dừa chứa nhiều chất dinh dƣỡng và chất kích thích tố tăng trƣởng nhƣ
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Vì vậy, A.
xylinum thích hợp phát triển trong môi trƣờng này [6].
Nƣớc dừa sau khi thu hoạch đƣợc sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đƣờng và các chất dinh dƣỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [7], [13].
2. Giới thiệu về thuốc berberin
Berberin là hoạt chất đƣợc chiết từ cây Hoàng đằng (còn có tên vàng

liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng
gây bệnh ( kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đƣờng ruột) [29].
Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E. coli, đặc biệt khi dùng sẽ
không ảnh hƣởng tới sự phát triển bình thƣờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột,
khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây
ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đƣờng ruột.
Berberin có tác dụng bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm
cholesterol và trygycerid, chống tiểu đƣờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm
viêm cho ngƣời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu
cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin [19].
2.4. Tương tác thuốc
Vitamin B6 và Nicotinamid có thể làm mất tác dụng kháng khuẩn của
berberin.

12


2.5. Chỉ định
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt [15].
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,
gió, lạnh, bụi, khói,...) và điều trị bệnh đau mắt hột [29].
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
2.6. Chống chỉ định
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin.
- Ngƣời dị ứng với berberin (rất hiếm gặp).
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming

sắc kí.
Đặc biệt tác giả Wan (Canada) [22 ] đã đƣợc đăng kí bản quyền về làm
màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czafa và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ
dƣỡng da cho phụ nữ.
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nƣớc ngày càng đƣợc cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng nhƣ màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,… Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK thu đƣợc là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [7].
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [14] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn

14


Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nƣớc tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.

15


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của

Khối lƣợng

Glucose

30g

Pepton

10g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Acid acetic

2%

Nƣớc dừa già

1000ml

Dịch giống A.xylium

10%