TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tận
tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Sự hiểu
biết sâu sắc về khoa học cũng nhƣ kinh nghiệm của cô là tiền đề giúp em đạt
đƣợc kết quả này.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo trong khoa
Sinh – KTNN, các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tận tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian em học tập và làm nghiên cứu tại Trƣờng.
Đây là những bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu sáng tạo khoa học,
kinh nghiệm của em còn nhiều hạn chế và bỡ ngỡ. Do đó, không tránh khỏi
những thiếu sót nên em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp quý báu của quý
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em đƣợc hoàn
thiện hơn nữa.

1.1.3. Một vài đặc điểm của màng CVK........................................................... 4
1.1.3.1. Cấu trúc của CVK ................................................................................ 4
1.1.3.2. Đặc tính của màng CVK ...................................................................... 5
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK.............................................................................. 6
1.2. Thuốc berberin ........................................................................................... 6
1.2.1. Cấu trúc ................................................................................................... 7
1.2.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 7
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 8
1.2.4. Tác dụng dƣợc lý và ứng dụng................................................................ 8
1.2.5. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH .............................................. 9
1.2.6. Tƣơng tác thuốc....................................................................................... 9
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................... 9
1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................ 9
1.3.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 10


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 12
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 12
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 12
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 12
2.1.4. Môi trƣờng tạo màng CVK ................................................................... 12
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 13
2.2.1. Phƣơng pháp lên men thu màng CVK từ môi trƣờng chuẩn ................ 13
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc ...................... 13
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ........................... 14
2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng chuẩn ..................................................... 15
2.2.5. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK ...... 16
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý thống kê ................................................................. 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17


Cộng sự

CVK

Cenllulose vi khuẩn

E. coli

Escherichia coli

Et al

An other

h

Giờ

OD

Optical Density

UV - vis

Ultraviolet visible


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng CVK............................................................. 13

học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối
thuốc và nhiều ứng dụng khác [18]. Trong lĩnh vực y học, màng CVK đã
đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da
cho con ngƣời [10, 18]. Amin et al. [15] đã báo cáo việc sử dụng màng CVK
làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả
cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm
tăng hiệu quả sử dụng của thuốc.
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK mới đƣợc quan
tâm gần đây và đã đạt đƣợc kết quả bƣớc đầu. Đề tài của Nguyễn Văn Thanh
– Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh 2006 [5] đã “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy
màng CVK đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất
trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn
nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn,
trọng lƣợng thấp, khả năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ, chứa nhiều
dƣỡng chất [13]. Đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn

1


cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn
định về kích thƣớc và hƣớng, màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải
phóng thuốc kéo dài [14, 20], có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ
thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đƣờng miệng và mô kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác,…
Berberin hydrocholoride (BH) đã đƣợc biết đến nhƣ một chất kháng
khuẩn tự nhiên trong việc điều trị các bệnh lí nhƣ tiêu chảy, viêm đƣờng tiêu
hóa do vi khuẩn tả, E. coli, amip đƣờng ruột [21]. Theo một vài nghiên cứu
gần đây, BH còn có tác dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính nhƣ

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tăng thêm hiểu biết về tiềm năng hấp thụ thuốc của màng CVK.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Từ hệ thống màng CVK đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ tốt nhất
nhằm cải thiện nhƣợc điểm của thuốc.
Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn (CVK)
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [11].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang
khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3µm, có thể di động hay không di động
và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhƣng đặc điểm nhuộm
gram có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trƣờng. Chúng
có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi [11].
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum
Nhiệt độ tối ƣu để A. xylinum phát triển là 25- 30oC và pH từ 5,4 - 6,3.
A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 - 8, nhiệt độ từ 12 – 35oC
và nồng độ ethanol có thể tới 10% [8].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A. xylinum bao gồm: oxy
hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dƣơng tính,
không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid,

Màng CVK có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thƣờng, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt (khoảng
100oC không gây ảnh hƣởng lớn đến tính chất của CVK nhƣng nhiệt độ thấp

5


có thể làm tăng tính mềm dẻo của nó), đặc biệt có khả năng cản khuẩn. Với
đặc tính này, CVK đã đƣợc ứng dụng làm màng lọc vô khuẩn [11].
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK
CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau
nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,...
đặc biệt trong lĩnh vực y học. Trong y học, màng CVK thu đƣợc từ quá trình
nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo để trị bỏng, đắp
lên các vết thƣơng hở. Ở Brazil, màng CVK ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất và
bán ra thị trƣờng nhƣ một loại da nhân tạo dùng đắp vết thƣơng [4]. Trƣờng
Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng
CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả
cho thấy rằng màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không cho vết
thƣơng nhiễm trùng [5]. Sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng làm màng băng
vết thƣơng, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan nội tạng,... Dựa vào đặc tính
trƣơng nở của CVK ngƣời ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, dùng
làm huyền phù CVK để ổn định các tá dƣợc dạng nƣớc, làm cho chúng không
bị tách khi bảo quản lâu ngày [4].
Ngoài ra CVK còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
nhƣ: Trong công nghiệp giấy màu CVK đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử
chất lƣợng cao, trong công nghiệp môi trƣờng đã sử dụng màng CVK làm
màng phân tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989,
Jonas và Fonah, 1998), dùng làm chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào
năng lƣợng (Brown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trƣờng cơ chất

mùi có vị rất đắng. Độ chảy khi ở dạng base là 1450C (bị phân hủy). Độ tan
dạng base tan chậm trong nƣớc 1/500, hơi tan trong ethanol, khó tan trong
ether. Dạng muối sulfat dễ tan trong nƣớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol. BH
không có nồng độ chất tan bất đổi nên không có đồng phân quang học [12].
Tính chất hóa học: BH có tính chất nhƣ một base yếu, tạo muối bằng
cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối BH không giống nhƣ các alkaloid khác
mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân
tử nƣớc [7].
1.2.4. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberin có tác dụng kháng khuẩn đƣợc dùng chủ yếu trong các bệnh
rối loạn đƣờng tiêu hóa [17]. Ngoài ra, berberin với liều nhỏ có tác dụng kích
thích tim, làm giãn mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung
khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê,
lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đƣờng huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và
sau đó thì hạ [17].
Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần và
mềm cơ, hạ huyết áp [2].
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: berberin có khả năng hạ
đƣờng huyết hiệu quả nhƣ metformin, cơ chế hoạt động bao gồm việc ức chế
aldose reductase, làm giảm đƣờng và ngăn ngừa sự kháng insulin [13].
Berberin làm giảm mạnh lƣợng cholesterol, triglycerid và xơ vữa nhƣng cơ
chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác dụng phụ
điển hình nhƣ statin [29]. Ngoài ra, berberin còn điều trị đƣợc chứng co giật
và bệnh động kinh, bảo vệ các tế bào thần kinh trong các trƣờng hợp tổn
thƣơng não do tắc mạch máu não gây ra, có tác dụng chống trầm cảm [25].

8


Tuyệt vời hơn nữa là tác dụng chống ung thƣ của berberin, nó có thể

berberin trong điều trị bênh tiểu đƣờng [30].
Chu L, Yang Y, Wang X và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về
berberin kích thích vận chuyển glucose thông qua một cơ chế khác biệt với
insulin [22].
- Màng CVK
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo [15], trong đó có 9
nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite.
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown. E. (2007)
[7] dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown
(2007), Jonas và Farad, (1998) [26] dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ
nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (2007) [17] đã dùng
CVK làm vải đặc biệt. Jonas và Farad, (1998) [26] dùng màng CVK để sản
xuất giấy chất lƣợng cao.
Tuy nhiên, những ứng dụng thƣờng thấy trên thế giới của màng CVK là
dùng trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Wan và Millon
(2009) [28], Czaja và cs, (2007) [27] sử dụng màng CVK đắp lên các vết
thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada)
[28] đã đƣợc đăng kí bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị
bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998) [26], Czaja và cs (2007) [27] đã dùng
màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ.
1.3.2. Ở Việt Nam
- Thuốc berberin

10


2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Vi
sinh khoa sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: Nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
Thuốc BH dạng tinh khiết (Sigma – Mỹ) và dạng chế phẩm bán trên thị
trƣờng.
Các hóa chất đặc biệt (cao nấm men, pepton) của hãng MERD, DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam
nhƣ amoni sunfat, diamoni phosphat, acid acetic, natri hydroxit, axit
clohydric, đƣờng glucose và một số hóa chất khác ở dạng tiêu chuẩn phân
tích.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius – Thụy sỹ), nồi hấp Tommy (Nhật), buồng cấy vô trùng (Haraeus);
Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức); Máy lắc tròn
tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); Tủ lạnh Electrolux; Máy lắc
TEIO TRCH (Hàn Quốc); Máy rung siêu âm; Bể ổn nhiệt.
Bình tam giác để lên men tạo màng CVK, hộp lồng, ống nghiệm, bình
định mức, pipet,…
2.1.4. Môi trường tạo màng CVK
A. xilynum đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn. Thành phần và khối
lƣợng các chất có trong môi trƣờng nuôi cấy màng CVK đƣợc thể hiện trong

12


bảng 2.1.


5

Pepton

5g

6

Axit citric

1,5g

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường chuẩn
Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ bảng 2.1.
Bƣớc 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng đó ở 113oC trong 15 phút.
Bƣớc 3: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút
rồi để nguội môi trƣờng.
Bƣớc 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
Bƣớc 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 – 14
ngày ở 26oC.
Bƣớc 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc.
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Quy trình xử lý màng CVK đƣợc trình bày trên hình 2.1.

13

Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc BH ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau:
5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% mg/ml trong dung dịch cồn 96o.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở bƣớc sóng 345nm [9].
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc BH để
xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc BH.
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc BH ở các nồng độ
khác nhau đƣợc thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3)
STT

Nồng độ

Giá trị OD 345nm (n = 3)

Giá trị trung

(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1


1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151

5

40

2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040

6


OD 345nm

1,0
0,5
0,0
0

10

20

30

40

50

60

Nồng độ dung dịch berberin (mg/ml)

Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn BH
Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
y = 0,0734x + 0,0074 (R2 = 0,9986)
Trong đó:

(1)

x: Nồng độ BH (mg/ml)
y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x

(Qt  Qd )
100
Qt

Trong đó:

(3)

EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.

𝑄𝑡: lƣợng thuốc lí thuyết.
𝑄𝑑 : lƣợng thuốc còn lại.
R

2.2.6. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu đƣợc phân tích xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và
đƣợc biểu diễn dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử
dụng hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α
= 0,05, những khác biệt đƣợc coi là ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật khoa Sinh học Trƣờng Đại
học Sƣ phạm Hà Nội.
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội 2.

17