ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ
LOÀI KIM GIAO
(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID
TỪ LOÀI KIM GIAO

(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


1.1.3. Ứng dụng ........................................................................................................ 4
1.1.4. Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học ................... 4
2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................................... 11
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 11
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 11
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế............................................................................. 11
2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 11
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ ................... 11
2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) ................................................ 12
2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS) ................................................. 12
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .......................................................... 13
2.4. Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS .......................... 15
2.5. Thực nghiệm ................................................................................................... 17
2.5.1. Phân lập các hợp chất........................................................................................ 17
2.5.2. Hằ ng số vâ ̣t lý và các dữ kiện phổ của các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p ................... 18

2.5.3. Định lượng các hợp chất.................................................................................... 19
3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được...................... 21
3.1.1. Hợp chất D1: ................................................................................................ 21
3.1.2. Hợp chất D2: ................................................................................................ 25
3.1.3. Hợp chất D3: ................................................................................................ 29
3.1.4. Hợp chất D4: ................................................................................................ 32
3.1.5. Hợp chất D5: ................................................................................................ 36
3.2. Xác định hàm lượng các hợp chất phân lập được bằng phương pháp LC/MS 40
3.2.1. Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1) ............................................... 40
3.2.2. Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2): .............................................. 42
KẾT LUẬN: ........................................................................................................... 45


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


HMBC

HSQC

NOESY

Proton Magnenic Rosonance
Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Carbon-13 Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance Spectroscopy

cacbon 13

Distortionless Enhancement
by Polarisation Transfer

Phổ DEPT

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Connectivity

Hình 3.4. Phổ HSQC của D1 .................................................................................. 24
Hình 3.5. Phổ HMBC của D1 ................................................................................. 24
Hình 3.6. Phổ NOESY của D1 ................................................................................ 25
Hình 3.7. Cấu trúc của D2 ...................................................................................... 25
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của D2 ............................................................................... 26
Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của D2.............................................................................. 26
Hình 3.10. Phổ HSQC của D2 ................................................................................ 28
Hình 3.11. Phổ HMBC của D2 ............................................................................... 28
Hình 3.12. Cấu trúc hợp chất D3 ............................................................................ 29
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của D3 ............................................................................. 29
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của D3............................................................................ 30
Hình 3.15. Phổ HSQC của D3 ................................................................................ 31
Hình 3.16. Phổ HMBC của D3 ............................................................................... 32
Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất D4 ............................................................................ 32
Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của D4 ............................................................................. 33
Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của D4............................................................................ 33
Hình 3.20. Phổ HSQC của D4 ................................................................................ 35
Hình 3.21. Phổ HMBC của D4 ............................................................................... 35
Hình 3.22. Phổ NOESY của D4 .............................................................................. 36
Hình 3.23. Cấu trúc hợp chất D5 ............................................................................ 36
Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của D5 ............................................................................. 37
Hình 3.25. Phổ 13C-NMR của D5............................................................................ 37
Hình 3.26. Phổ HSQC của D5 ................................................................................ 39
Hình 3.27. Phổ HMBC của D5 ............................................................................... 40
Hình 3.28. Diện tích pic chất D1 (PE1) trên mẫu tổng .......................................... 42
Hình 3.29. Diện tích pic chất D2 (PE2) trên mẫu tổng .......................................... 44


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1.1. Số liệu phổ hợp chất D1 và chất tham khảo ........................................ 23

Phụ lục 17. Phổ HMBC của D4 ....................................................................... 9 - PL
Phụ lục 18. Phổ NOESY của D4 ...................................................................... 9 - PL
Phụ lục 19. Phổ 1H-NMR của D5 ................................................................... 10 - PL
Phụ lục 20. Phổ 13C-NMR của D5 .................................................................. 10 - PL
Phụ lục 21. Phổ HSQC của D5 ...................................................................... 11 - PL
Phụ lục 22. Phổ HMBC của D5 ..................................................................... 11 - PL


Mở đầu
Hiện nay, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang ngày càng được ưa
chuộng do những đặc tính nổi bật của chúng như: ít độc, ít gây phản ứng phụ, dễ
hấp thu. Từ ngàn xưa ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây cỏ
để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể, hay tạo mùi thơm... Do đó ngày nay các hợp chất có
hoạt tính sinh học trong thực vật và động vật đang nhận được sự quan tâm rất lớn
từ giới khoa học. Trong tương lai, các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ đóng vai
trò rất quan trọng, là các yếu tố khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại dược
phẩm mới có tác dụng tốt hơn.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, có khí hậu nóng, độ ẩm cao, lượng
mưa lớn, là những điều kiện rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các
loài thực vật. Với hệ thực vật phong phú và đa dạng khoảng 12.000 loài thực vật
bậc cao có mạch, trong đó có tới 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược,
điều này là một tiền đề lớn cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên
nhiên ở nước ta. Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng
dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa
học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí và có hiệu quả có ý nghĩa đặc biệt
quan trọng. Kim giao hay còn gọi Kim giao núi đá (danh pháp khoa học Nageia
fleuryi hay Podocarpus fleuryi) là một loài thực vật trong họ Podocarpaceae. Lá
loài này được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi và dùng
làm thuốc giải độc…
Ở Việt Nam, chưa thấy có công bố nào về thành phần hóa học của loài này.

(Podocarpaceae). Một vài phân loại khoa học trước đây xếp chi Kim giao vào
chi Thông tre (Podocarpus). Đến năm 1987 thì người ta bắt đầu tách riêng chi Kim
giao (Nageia).
Ở Việt Nam, chi Kim giao được ghi nhận có 3 loài là: Kim giao đế mọng
(Nageia wallichiana hay Podocarpus wallichiana), Kim giao hạt to (Nageia fleuryi
hay Podocarpus fleuryi) và Kim giao hạt nhỏ (Nageia nagi hay Podocarpus nagi).
Cây kim giao hạt to (Nageia fleuryi) là một loài cây thân gỗ nhỡ cao từ 1525m. Thân thường thẳng và tán cây hình tháp. Các cành nhánh của cây thường
mọc ngang và rủ xuống. Vỏ thân cây màu nâu xám và thường bong mảng. Lá cây
thường có hình bầu dục hoặc mũi mác, đầu lá hình nhọn, đuôi lá hình nêm. Lá dài
15-18cm, rộng 4-5cm Hệ gân lá thuộc dạng đa gân, đặc trưng của thực vật chi
Nageia. Bề mặt phiến lá thường trơn bóng như chất liệu da. Lá đính đơn và đối
HV: Nguyễn Duy Hải

3


xứng nhau qua cành. Nón đực thường đính thành chùm 3-4, nón cái thường mọc
đơn lẻ ở nách lá. Quả hình trụ đường kính từ 1,5 - 2,5 cm.
Cây ra nón vào tháng 5; nón chín vào tháng 11-12.
1.1.2. Phân bố và sinh thái
Kim giao được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng
Tây, Vân Nam), Lào, Campuchia, Việt Nam (hầu hết các tỉnh miền núi có địa chất
đá vôi).
Loài ưa phát triển trên đất đá vôi có độ dày tầng đất lớn, thoát nước tốt. Ngoại
trừ trường hợp đặc biệt về quần hợp đơn loài ở Vườn quốc gia Cát Bà của Việt
Nam thì Kim giao là loài thường phân bố hỗn giao với các loài Sến, Táu và Dẻ ở
các khu rừng mưa nhiệt đới và á nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 200 - 1000m.
Ở Việt Nam, chi này phân bố khá rộng, từ Cao Bằng, Phú Thọ, Hải Phòng,
Ninh Bình đến Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng.
1.1.3. Ứng dụng

nagilactone A (12) được Yuji Hayashi và cộng sự phân lập [4]. Tiếp tục các
nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ rễ loài P. nagi nhóm tác giả trên thông
báo cấu trúc ba hợp chất mới diterpenoid dilactone dạng 7,8-epoxy-enolide: 16hydroxy-podolide (13), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (14) và 2β,3β-epoxypodolide (15) [5]. Cũng từ vỏ rễ loài P. nagi, Bai-Ping Ying và cộng sự đã phân
lập được ba hợp chất norditerpene dilactone: 2,3-dehydro-16-hydroxynagilactone F
(16), nagilactone I (17) và 16-hydroxynagilactone E (18) [6]. Năm 1990 và 1991
nhóm tác giả Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding và He Qi-min đã công bố cấu trúc của
16 hợp chất được phân lập từ loài P. fleuryi: palmitic acid (19), sugiol (20), βsitosterol (21), nagilactone A (1), nagilactone B (2), isoginkgetin (22), β-sitosteryl
stearate (23), 3β,5α-dihydroxy-6-stigmastanone (24), 5α-hydroxy-6-stigmastanone3β-palmitate (25), daucosterol (26), syringin (27) và 5 hợp chất robustaflavone
(28-32) [7]. Năm 1991, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được hợp chất 2αhydroxynagilactone F (33) từ vỏ rễ loài P. nagi và kết quả thử nghiệm hoạt tính
kháng nấm cho thấy hợp chất này có hoạt tính đối với chủng nấm S. cerevisiae
(MIC 800 µg/ml) [8]. Từ lá loài P. nagi, bảy hợp chất được phân lập: 3-deoxy-2αhydroxy-nagilactone E (34), 3-epi-nagilactone C (35), 15-methoxy-nagilactone D
(15), sugiol (20), nagilactone A (1), nagilactone C (3), vomifoliol (36) [9] và từ
vỏ rễ loài này, sáu hợp chất: nagilactone J (37), nagilactone C (3), nagilactone D
(4), nagilactone I (17), 16-hydroxynagilactone E (18) và vomifoliol (36) đã được
phân lập [10].

HV: Nguyễn Duy Hải

5


Một nghiên cứu khác của Isao Kubo về tác dụng kháng khuẩn, sáu hợp chất
diterpenoid: totarol (38), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), totaral (41),
HV: Nguyễn Duy Hải

6


4β-carboxy-19-nortotarol (42), sugiol (20) đã được phân lập và thử tác dụng kháng
khuẩn trên 12 chủng, kết quả cho thấy hợp chất totarol thể hiện hoạt tính kháng



chuyển vị và phosphoryl hóa protein mitogen-activated protein kinase (MAPK)
[16]. Năm 2013, từ cành và lá loài P. fleuryi, Lan-Chun Zhang đã phân lập được ba
hợp chất abietane diterpenoid mới: fleuryinol A-C (55-57), cùng với 14 hợp chất
đã biết: 19-hydroxyferruginol (58), lambertic acid (59),

inumakiol

D (60),

totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), 3-acetoxy-methyl-5-[(E)-3-acetoxypropen1-yl)]-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran

(61),

divanillyltetrahydrofuran (62), (+)-pinoresinol (63), ligballinol (64), sitostane3β,5α,6β-triol (65), ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol (66), stigmast-4-ene-3β,6βdiol (67), stigmast-5-ene-3β,7β-diol (68) và ergosterol peroxide (69). Tám hợp
chất (55-62) được đáng giá hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào: HL-60,
SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 kết quả cho thấy hợp chất fleuryinol B
(56) và 19-hydroxyferruginol (58) có hoạt tính trung bình đối với dòng tế bào
SMMC-7721 và A-549 với giá trị IC50 lần lượt là 38 và 14 µM [17]. Một nghiên
cứu được công bố vào tháng 01 năm 2016 của các nhà khoa học Trung Quốc về
loài P. wallichiana cho thấy đã phân lập được bốn hợp chất: sugiol (20), vanillic
axit (70), p-hydroxybenzoic axit (71) và 7-ketositosterol (72). Cấu trúc của chúng
được xác đinh bằng các phương pháp phổ NMR và đây là nghiên cứu hóa học đầu
tiên về loài này [18].

HV: Nguyễn Duy Hải

8


2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G
F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định
vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách
kết tinh trong dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha
đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240- 430 mesh). Silica gel
pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion
Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào ứng
dụng của các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng
chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu
cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác
HV: Nguyễn Duy Hải

11


định cấu trúc hóa học của hợp chất người ta phải dựa vào các phương pháp phổ
khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với phương pháp sắc kí so sánh…
2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên
kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết
được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại
có thể xác định các nhóm đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của
nhóm OH tự do trong các nhóm hyđroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại và
hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều
và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu
trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và

C) dưới tác dụng của từ

13

trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
2.3.3.1. Phổ 1H - NMR
Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0- 14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác định
được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
2.3.3.2. Phổ 13C - NMR
Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng
ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C - NMR
là ppm, với dải thang độ rộng 0- 230ppm.
2.3.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT
cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2
nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu
phổ của các CH.
2.3.3.4. Phổ 2D - NMR
Đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của các hạt nhân từ

phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất
hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử dụng kết
hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân
tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt với phân tử nhiều mạch chính dài, tín hiệu phổ
NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác chiều dài các mạch. Đối
với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác các loại đường cũng
HV: Nguyễn Duy Hải

14


như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác
định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự
kiến.
2.4. Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS/MS
Phương pháp này có ưu điểm là nhận diện rất rõ ràng cả về định tính và định
lượng, đồng thời các phương pháp này rất nhạy và thích hợp cho việc đánh giá độ
sạch của hợp chất.
- Thiết lập thông số cho sắc lý lỏng


Các lựa chọn cho hệ dung môi:

Các hệ dung môi: acetonitrile/nước (25:75, v/v)


Các lựa chọn cột sắc ký:

Cột Sunfire -C18 RP (4,6 x 150 mm), 5µm

0
100
20 - 30
0
100
30 - 35
80
20
- Detector PDA : bước sóng 225 nm. Thể tích mẫu bơm vào máy 5µl
Thông số của detector MS:
HV: Nguyễn Duy Hải

15


- Sử dụng nguồn ion hóa ESI: thông số nhiệt độ khí nito của nguồn 280 0C, áp
suất khí 30psi, lưu lượng khí 8lit/phút, điện áp của nguồn 4,5Kv, Mod đo negative
với các ion định lượng được phân mảnh với năng lượng va chạm (CID) của khí
heli trong Trap là 0,7 -1,0 Ampl.
- Chuẩn bị mẫu phân tích:
 Cân chính xác mẫu khô (3 lần)
 Chiết siêu âm (3 lần, mỗi lần 30 phút)
 Cô quay thu được cao chiết tổng, cân khối lượng
 Pha cao chiết tổng trong metanol
- Xây dựng đường chuẩn:
Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được pic nào trên sắc ký đồ tương
ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác
nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất phân tích bằng phương pháp đường
chuẩn, cách thức làm như sau:
 Vẽ đồ thị của diện tích pic theo nồng độ, từ đó dùng chương trình bình