ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN
QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG
LÚA Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN
QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG
LÚA Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội

NCS xin chân thành cảm ơn các thầy,các cô Bộ môn Di truyền (Khoa
Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy NCS trong quá trình học tập và
tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) và các bạn
bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để NCS hoàn thiện bản luận án
này.
Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi,
quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
luận án.
Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2017

NCS Cao Lệ Quyên


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ 1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... 5
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 9
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... 12
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 14
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 20
1.1. HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NÔNG
NGHIỆP

................................................................................................... 20

1.1.1. Khái niện về hạn hán ............................................................... 20
1.1.2. Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ........... 21
1.2. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN............. 24
1.2.1. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật ................................... 24
1.2.2. Đáp ứng chống, chịu hạn của thực vật ...................................... 26

2.2.10. Đánh giá sinh trƣởng, phát triển, khả năng chịu hạn của lúa
chuyển gen ...................................................................................... 74

2


2.2.11. Đánh giá biểu hiện gen OsDREB1A bằng phƣơng pháp PCR định
lƣợng .............................................................................................. 75
2.2.12. Đánh giá biểu hiện gen bằng phƣơng pháp PCR bán định lƣợng76
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 77
3.1.

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

OsDREB1A/OsDREB2A .............................................................................. 77
3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A ..................... 77
3.1.2. Thiết kế vector chuyển gen OsDREB1A/OsDREB2A ................. 92
3.1.3. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens chủng LBA4404 .. 94
3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA Ở
VIỆT NAM .................................................................................................. 95
3.2.1. Khả hình thành callus của tập đoàn giống lúa Việt Nam ............. 95
3.2.2. Khả năng tái sinh của tập đoàn giống lúa Việt Nam ................... 99
3.2.3. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen của giống lúa Việt Nam ........ 103
3.3. TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN ........................ 108
3.3.1. Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành
trụi ................................................................................................ 108
3.3.2. Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen .............................. 108
3.4. ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌ NH CÂY CHUYỂN GEN .............................. 118
3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen
T2 ................................................................................................. 118


Arabidopsis thaliana

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

ABA

Abscisic acid

ABRE

Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT
(ACGT-containing abscisic acid response element)

AD

Vùng tác động (acting domain)

ADB

Ngân hàng phát triển châu Á (Asian Development
Bank)

AMP

Adenosine monophosphate

ADP

acid)

5


CDBK

protein kinase phụ thuộc canxi (calciumdependent protein kinase)

Ct

Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle)

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DMSO

Dimethyl sulfoxide

dNTP

Deoxyribonucleoside Triphosphate

DRE


HSP

Protein sốc nhiệt (Heat shock protein)

HK

Histidine Kinase

IPCC

Ủy ban liên chính phủ về Biến đổi khí hậu
(Intergovernmental Panel on Climate Change)

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

6


kb

Kilobase

LB

Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani

LEA


1-naphthaleneacetic acid

NAC

NAM – No Apica Meristem/ATAF1-Arabidopsis
transciption activation factor /CUC- Cup shaped
cotylendon

NACRS

Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition
sequence)

NST

Nhiễm sắc thể

OD

Mật độ quang học (optical density)

ORF

Khung đọc mở (open reading frame)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain
reaction)


SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Điện di gel polyacrylamide có chƣ́a SDS (SDS Polyacrylamide gel electrophoresis)

sqRT-PCR

Phản ứng nhân bản gen bán định lƣợng

TAE

Đệm Tris-acetate-EDTA

TBE

Đệm Tris-borate-EDTA

TE

Đệm Tris-EDTA

TF

Nhân tố phiên mã (transcription factor)

Ti-plasmid

Hình 3.9 | Kết quả so sánh trình tự OsDREB2A ............................................. 91
Hình 3.10 | Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc biến nạp vector chuyển
gen ................................................................................................................... 93
Hình 3.11 | Kết quả điện di kiểm tra PCR các khuẩn lạc Agrobacterium tái tổ
hợp ................................................................................................................... 94

9


Hình 3.12 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 1-24 ............. 96
Hình 3.13 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 25-47 ........... 97
Hình 3.14 | Khả năng tái sinh của các giống lúa ........................................... 101
Hình 3.15 | Phản ứng của 5 giống lúa khi chuyển gen theo quy trình I ........ 103
Hình 3.16 | Quy trình chuyển gen giống Chành trụi sử dụng nền môi trƣờng
MS ................................................................................................................. 106
Hình 3.17 | Hình ảnh tƣ liệu hóa các bƣớc trong quy trình chuyển gen vào
giống lúa Chành Trụi .................................................................................... 107
Hình 3.18 | Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây Chành trụi chuyển
gen ................................................................................................................. 110
Hình 3.19 | Kết quả điện di sản phẩm PCR cây chuyển gen biến nạp cấu trúc
pBIG/Ubi:OsDREB2A với 02 cặp mồi đặc hiệu gen chuyển/Hygromycin .. 111
Hình 3.20 | Kết quả kiểm tra số bản sao cây chuyển gen bằng lai Southern
Blotting .......................................................................................................... 114
Hình 3.21 | Kết quả sàng lọc cây chuyển gen đồng hợp qua thông qua tỷ lệ
nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin ........................................................ 115
Hình 3.22 | So sánh một số chỉ tiêu sinh trƣởng giữa các dòng cây chuyển
gen T2 ..................................................................................................... 119
Hình 3.23 | Độ hụt khối của các dòng lúa chuyển gen T 2 khi mất nƣớc
cƣỡng bức .............................................................................................. 121
Hình 3.24 | Khả năng gữ nƣớc và phục hồi của các dòng chuyển gen T 2 sau

sinh của 26 giống lúa..................................................................................... 100
Bảng 3.4 | Kết quả khảo sát khả năng tái sinh của 26 giống lúa có khả năng
tạo callus tốt .................................................................................................. 102
Bảng 3.5 | Khả năng tiếp nhận gen của 5 giống lúa Việt Nam ..................... 104
Bảng 3.6 | Kết quả biến nạp các vector chuyển gen vào lúa Chành Trụi ..... 108
Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0 ....................................... 112
Bảng 3.8 | Kết quả theo dõi của các dòng lúa chuyển gen T0 ....................... 112
Bảng 3.9 | Kết quả ƣớc tí nh số lƣợng bản sao và tì nh trạng đồng hợp các
dòng T1................................................................................................ 117
Bảng 3.10 | Kết quả sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen T 1 đồng hợp
tử......................................................................................................... 118
12


Bảng 3.11 | Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây chuyển gen T2 và cây đối
chứng ............................................................................................................. 119
Bảng 3.12 | Khả năng giữ nƣớc của các dòng lúa chuyển gen T2................. 121
Bảng 3.13 | Khả năng phục hồi, kết hạt của các dòng lúa chuyển gen T 3 sau
xử lý hạn ........................................................................................................ 125

13


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với khoảng 70% dân số sinh sống ở
nông thôn và 48% lấy nông nghiệp làm sinh kế. Do đặc điểm tự nhiên và điều
kiện nền kinh tế, phần lớn các hoạt động sản xuất nông nghiệp của nƣớc ta
trong đó có sản xuất lúa gạo (nguồn lƣơng thực chính) bị phụ thuộc vào
nguồn nƣớc mƣa tự nhiên và nguồn nƣớc đổ về qua hai hệ thống sông Hồng
(miền Bắc) và sông Mekong (đồng bằng sông Cửu Long). Do đó, hạn hán

các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên
những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, cùng với sự phát
triển các kỹ thuật microaray, proteomic..., các nhà khoa học đã phát hiện và
chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng
cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen điều khiển mặc dù không tham gia
trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhƣng sự biểu
hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng
khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng
chịu hạn ở thực vật.
Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu rất cho lĩnh vực chọn
giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển một hay một vài gen điều
khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cƣờng tính chống chịu
của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá
các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hƣớng
nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chuyển gen/chọn tạo giống chịu hạn.
Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân
lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ
chuyển gen thực vật đã bắt đầu đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy
nhiên, hầu hết các chƣơng trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress
môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều đƣợc tiến hành với

15


nguồn vật liệu hoặc nền di truyền không phải của Việt Nam, do đó tính ứng
dụng ra thực tiễn sản xuất ít nhiều bị hạn chế. Xuất phát từ thực tế nêu trên,
chúng tôi đã đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và
chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục
đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây
trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn.

16


(ii) Khả năng tạo callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens của một số giống lúa trồng ở phía Bắc Việt Nam.
Các nội dung nghiên cứu chính:


Nội dung 1: Phân lập và thiết kế vector chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A của giống lúa Việt Nam dƣới sự điều khiển của
promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9).


Nội dung 2: Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống lúa

trồng ở Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.


Nội dung 3: Tạo giống lúa Chành Trụi chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A.


Nội dung 4: Đánh giá kiểu hình và biểu hiện của các dòng

chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn tại phòng thí nghiệm.

Địa điểm nghiên cứu
Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Phân

từng giống lúa. Điều này càng ý nghĩa hơn khi thời gian gần đây với công
nghệ chỉnh sửa hệ gen đang có những bƣớc tiến dài, chúng ta có thể tạo ra
đƣợc các giống lúa công nghệ sinh học không qua lai tạo, có các đặc điểm
nông sinh học vƣợt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu.
Trong luận án này lần đầu tiên ở Việt Nam, phản ứng PCR định lƣợng
đƣợc áp dụng thành công để ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển
gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T 1. Phƣơng
pháp này có một số ƣu thế so với các phƣơng pháp trƣớc đó: tiết kiệm thời
gian và vật liệu thí nghiệm, mức độ chính xác cao và xác định đƣợc thể đồng
hợp ngay ở thế hệ T1 và rất phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn
nhiều hạn chế trong nƣớc.
Ứng dụng thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng T3 (đồng hợp,
một bản sao gen OsDREB1A dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng Lip9)
có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả
năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tƣới nƣớc. Đây là kết quả quan
trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsDREB1A và điều hòa biểu

18


hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã dƣới sự điều khiển của promoter cảm
ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của
luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A đƣợc tạo ra đang
đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu
tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng
nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu.
Ngoài ra dòng chuyển gen tiếp tục đƣợc duy trì theo dõi trong nhà lƣới để làm
nguyên liệu cho công tác lai tạo giống khi điều kiện thực tế cho phép (chấp
nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra).


20


diện thƣờng dẫn đến hiện tƣợng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục
hồi. Ở nƣớc ta, hạn toàn diện thƣờng xảy ra ở các tỉnh miền Trung nhƣ Nghệ
An, Hà Tĩnh..., gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng nói chung và cây lúa nói
riêng [9, 11, 16].
1.1.2. Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

Trong các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, hạn hán là nhân tố chính và
phổ biến nhất gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp. Hiện nay,
các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích
đất nông nghiệp trên toàn thế giới, và đƣợc dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối
thế kỉ 21 [11]. Mức độ ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp phụ
thuộc vào tần xuất, cƣờng độ, tính khắc nghiệt của đợt hạn hán và cả tính
nhạy cảm của từng đối tƣợng cây trồng. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với nông
nghiệp có thể diễn ra hàng năm hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất
lƣợng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do
sâu bọ, tăng chi phí tƣới tiêu, dẫn tới làm mất sản lƣợng cây trồng và giảm thu
nhập của ngƣời nông dân [10].
Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thƣờng xuyên xảy ra ở vùng
miền Bắc . Tình trạng hạn hán bắt đầu từ cuối tháng

7 hàng năm gây ảnh

hƣởng nghiêm trọng đến vùng trồng ngô lớn nhất tại đây (chiếm 60% tổng
diện tích trồng trọt). Nền sản xuất nông nghiệp ở Ấn Độ cũng thƣờng xuyên
phải đối mặt với các đợt hạn hán nghiêm trọng. Đặc biệt đợt hạn hán năm
2010 đã khiến tăng trƣởng của quốc gia này giảm 1%. Đợt hạn hán tồi tệ