1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEN CODA LÀM CHỈ THỊ CHỌN LỌC
VECTOR CHUYỂN GEN MANG TÍNH AN TOÀN SINH HỌC

NGUYỄN THỊ HÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN NĂM 2015


2
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan…………………………………………………………...

i

Lời cảm ơn……………………………………………………………...

ii

Mục lục…………………………………………………………………

iii

Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu…………………………………..


1.1.2. Chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens...................
1.1.2.2. Đặc điểm của Ti-plasmid...........................................................
1.1.2.3. Cơ chế chuyển gen vào thực vật ................................................
1.1.2.4. Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen ở thực vật.........
1.2. Các gen sử dụng trong chọn lọc và chỉ thị.......................................
1.2.1. Gen kháng kháng sinh…………………………………………...
1.2.2. Gen kháng chất diệt cỏ…………………………………………..
1.2.3. Gen chọn lọc mannose…………………………………………...
1.2.4.Gen chỉ thị………………………………………………………...
1.3. 1.3. Tổng quan nghiên cứu về vector chuyển gen mang tính an toàn
sinh học....................................................................................................
1.3.1. Sự cần thiết nghiên cứu vector chuyển gen mang tính an toàn
sinh học....................................................................................................
1.3.2. Các gen/hệ thống chọn lọc thân thiện............................................
1.3.3. Sự loại bỏ các gen chỉ thị chọn lọc từ cây chuyển gen…………..
1.4. Cơ sở khoa học trong sử dụng gen codA làm chỉ thị chọn lọc ở
thực vật chuyển gen…………………………………………………….
1.4.1. Glycine betaine đối với tính chống chịu điều kiện môi trường bất
lợi ở thực vật……………………………………………………………..
1.4.2. Giới thiệu về gen codA sử dụng…………………………………
1.4.3. Các nghiên cứu chuyển gen codA nhằm tăng cường khả năng

4
4
4
5
5
6
7

2.2.4. Phương pháp xử lý ADN bằng enzyme cắt giới hạn…………….
2.2.5. Phản ứng nối ghép gen…………………………………………..
2.2.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
E.coli……………………………………………………………………………
2.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp……………………...
2.2.8. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
A.tumefaciens C58/PGV2260 bằng xung điện…………………………
2.2.9. Phương pháp tạo cây thuốc lá chuyển gen………………………
2.2.10. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ phiên mã
bằng kỹ thuật RT-PCR…………………………………………………
2.2.11. Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các dòng thuốc lá K326
chuyển gen codA……………………………………………………….
2.2.12. Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen in
vitro……………………………………………………………………………..
2.2.13. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu…………………………
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………
3.1. Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen
codA…………………………………………………………………….
3.1.1. 3.1.1. Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/35S-codA mang
gen codA hoạt động dưới sự điều khiển của promoter cơ định 35S……
3.1.2. Thiết kế vector pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen codA hoạt
động dưới sự điều khiển của promoter HSP 18.2....................................
3.1.3. Kết quả loại bỏ gen chọn lọc hptII mã hóa cho hygromycin
phosphotransferase khỏi vector pCAMBIA1301/HSP-codA…………
3.1.4. Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen
3.2 . Kết quả chuyển gen codA vào cây thuốc lá K326………………...
3.2.1. Chuyển cấu trúc pCAMBIA1301/HSP-codA vào cây thuốc lá
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens………………………………………….
3.2.2. Sàng lọc khả năng chịu nhiệt của dòng thuốc lá chuyển gen
trong in vitro …………………………………………………………...

43
44
44
45
47


4
3.2.4. Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen trong
in vitro…………………………………………………………………………..
3.2.5. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen codA bằng kỹ thuật RT-PCR.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………...

48
49
51
52


5
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây
trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện
đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái
tổ hợp, chuyển một hoặc một số gen chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính
trạng mong muốn. Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn
gọi là giống truyền thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền.
Điểm khác biệt duy nhất giữa giống lai truyền thống và giống chuyển gen là

Từ những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp glycine betaine và
proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ
gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân
lập được các gen: codA (COD-Choline oxidase), COX, BADH, betA (CDH),
CMO, GSMT(glicine Sarcosine methyntransferase), SDMT (Sarcosine
dimethylglucine

methyltransferase),

P5CS

(Pyrroline

-5-Carboxylate

Synthetase) và P5CR (Pyrroline -5-Carboxylate) từ nhiều nguồn khác nhau,
mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB và proline.
Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và
chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen
tăng cường khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường. Các kết quả
đã được công bố cho thấ y: các gen codA (COD), COX, BADH, betA (CDH),
CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR được chuyển vào các đối tượng cây
Arabidopsis thaliana, Cây thuốc lá, cây lúa (Oryza sativa), cây cà chua, cây
hồng, cây bạch đàn, cây cải bẹ (Brassica juncea), bông, ngô ... giúp cho cây
tăng cường khả năng chiụ la ̣nh, nhiê ̣t độ cao, chịu mă ̣n và băng giá codA là
gen mã hóa cho choline oxidase là enzyme tham gia tổng hợp GB. Trong
chuyển gen, các nhà khoa học đã sử dụng gen codA (COD) cho thấy cây
chuyển gen có khả năng phát triển bình thường trong điều kiện bất lợi như
nóng, mặn, khô hạn xảy ra.


một hoặc nhiều gen vào trong bộ gen của cây trồng. Hiện nay có nhiều
phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu và thành công trên
nhiều đối tượng giống cây trồng như: chuyển gen thông qua A.tumefaciens,
chuyển gen trực tiếp bằng hóa chất, xung điện, súng bắn gen, chuyển gen
bằng vi tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng ủ dung dịch hạt khô
với dung dịch DNA… Hai phương pháp chuyển gen thành công nhất là
chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi
khuẩn A.tumefaciens.
1.1.1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen
Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen là phương pháp đưa các gen
ngoại lai vào tế bào chủ, là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là vàng (hoặc Vonfam)
kích thước hiển vi (0.5-5um) có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và
màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào.
Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen được áp dụng với những đối tượng
mà việc chuyển gen bằng A.tumefaciens khó thực hiện được (do không mẫn cảm
với A.tumefaciens) hay khả năng tái sinh kém (khi chuyển gen vào tế bào trần).
Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho rất nhiều loại cây trồng,
đặc biệt là thực vật một lá mầm như lúa mì hoặc ngô.
Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen được sử dụng rộng rãi sau
phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn A.tumefaciens với các ưu điểm là có thể
áp dụng với hầu hết các loại mô và tế bào, chuyển DNA ngoại lai vào tế bào
nhanh, dễ sử dụng với quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được
xử lý trong thời gian ngắn, các vecto được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi
các trình tự DNA cho đoạn T-DNA như chuyển gen bằng A.tumefaciens, cần


9
một lượng nhỏ plasmid DNA, biểu hiện gen tạm thời có thể được quan sát sau
vài ngày. Tuy nhiên cũng có nhược điểm như nhiều bản sao vào tế bào cùng
một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích chọn lọc về sau này, hiệu quả

Ti plasmid - một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân
tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Ti plasmid có kích thước khoảng 200 kb, trong tế
bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập gồm 4 vùng tương đồng:
Vùng T-DNA (transfer-DNA) được giới hạn bởi vùng biên phải (right border)
và vùng biên trái (left border) và luôn được chuyển sang tế bào thực vật. Tại
đây có hai hệ gen: hệ gen gây khối u onc (oncogenic) gồm các gen khi hoạt
động sẽ sản sinh một lượng lớn các chất kích thích sinh trưởng như auxin,
cytokinin tạo thành khối u ở thực vật; hệ gen mã hoá một số enzym điều
khiển quá trình tổng hợp các dẫn suất của các axit amin hay đường, gọi là
opin. Vùng liên quan đến sự tái bản (origin of replication). Vùng liên quan
đến sự tiếp hợp (Conjugative transfer). Vùng virulance chứa các gen vir, giữ
vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực
vật 21.

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid của vi khuẩn A. Tumefaciens 90.
Phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens được ứng dụng rộng
rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng nhờ những đặc tính ưu việt
của hệ thống chuyển gen này: giúp tạo cây trồng có tính bền vững cao; có thể
chuyển một đoạn DNA có kích thước tương đối lớn vào thực vật mà không
cần thiết bị cũng như hệ thống nuôi cấy phức tạp; số bản copy của gen chuyển


11
trong cây chuyển gen ít, tạo thuận lợi cho việc phân tích cũng như nghiên cứu
sự biểu hiện của gen mới trong cây chuyển gen 27.
1.1.2.3. Cơ chế chuyển gen vào thực vật
Vùng T-DNA (transfer DNA) chuyển vào thực vật có kích thước
khoảng 10-20 kb, nằm kẹp giữa 2 trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là
biên trái (left border-LB) và biên phải (right border-RB). Đoạn T- DNA muốn

quả.
* Hệ thống vector liên hợp
Hệ thống vector liên hợp là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Tiplasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng
vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là
đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để
phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid
tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium.
Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ
cho việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại
plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua trao đổi chéo giữa hai đoạn tương
đồng và hình thành vector liên hợp. Thực chất vetor liên hợp là một loại
vector lai có chỗ cho lai cần chuyển đi nhờ vào tế bào thực vật 2.
* Hệ vector nhị thể
Việc sử dụng trực tiếp Ti-plasmid của A.tumefaciens chuyển gen gặp khó
khăn do nó có kích thước lớn. Mặt khác, Ti-plasmid chứa các gen gây khối u
gây bất lợi cho thực vật- cản trở quá trình sinh trưởng và phát triển bình
thường ở thực vật. Các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở
nhiều chỗ khác nhau. Trong khi đó công nghệ gen lại cần những vị trí cắt duy
nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn 1. Với các lí do trên đây, các
nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có
vector chuyển gen (Ti-plasmid tái tổ hợp) và vector bổ trợ (helper T-plasmid).
Vector chuyển gen có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn DNA được cắt
bỏ hết các gen không cần thiết như gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai


13
trình tự LB và RB, gắn thêm một số thành phần tạo cấu trúc mới gồm: Các
replicon để DNA plasmid có thể vừa tự nhân bản trong cả E.coli và A.
tumefaciens; các gen chọc lọc, gen chỉ thị và vùng có chứa nhiều điểm cắt của
các enzyme giới hạn nằm ở hai trình tự LB và RB để chèn gen mong muốn

1.2.3. Gen chọn lọc mannose
Một trong những gen chọn lọc tích cực được sử dụng nhiều là gen mã
hóa biến dưỡng đường manose, là một ví dụ điển hình trong việc sử dụng
thành công chất chọn lọc thay thế các kháng sinh và chất diệt cỏ trong chuyển
gen (hình 1.2) - Gen manA được tách từ Escherichia coli 52. Gen manA mã
hóa cho enzym phosphomannose isomerase (PMI) sẽ biến đổi mannose-6phosphate thành fructose-6-phosphate có thể sử dụng như là chất dinh dưỡng
của tế bào. Vì thế các tế bào mang gen chuyển sẽ phát triển được trên môi
trường có đường manose thay vì sacrose trong điều kiện bình thường. Đối với
các tế bào không chuyển gen, bản thân đường mannose không gây độc, nhưng
khi bị phốtpho hóa bởi hexokinase thành mannose-6-phosphate dẫn đến các tế
bào không thể phát triển được.

Hình 1.2. Quy trình sử dụng mannose làm chất chọn lọc 93.
1.2.4. Gen chỉ thị
GFP (green fluorescene protein): Gen tổng hợp GFP được phát hiện và
tách từ loài sứa Aequorea victoria. Protein GFP rất dễ phát hiện, chỉ cần quan
sát dưới kính hiển vi phát huỳnh quang, máy đếm tế bào, máy quang phổ đo
huỳnh quang. Protein có tính ổn định cao, tồn tại lâu, không cần co-enzym
như các hệ thống phát màu, phát ánh sáng hay phát huỳnh quang khác, ít xảy
ra dương tính giả, độ chính xác khá cao, không phá hủy tế bào.


15
GUS (β-1,4-glucuronidase): Gen gus A mã hóa cho sinh tổng hợp
enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự
phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc
trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận
biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dglucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme βglucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm.
1.3. Tổng quan nghiên cứu về vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học
1.3.1. Sự cần thiết nghiên cứu vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học

đối với cây đã trồng ngoài cánh đồng. Việc có mặt của các gen chọn lọc này
trong cây trồng chuyển gen đã gây nên những lo lắng trong công chúng về
mặt sức khỏe của con người sử dụng và môi trường. Mặc dù, cho đến hiện
nay chưa có thí nghiệm nào đưa ra được bằng chứng rằng các gen chọn lọc
kháng lại các chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ đang sử dụng có nguy cơ gây
hại đến sức khỏe người hoặc vật nuôi. Tuy vậy những lo ngại trên, thực tế đã
làm chậm quá trình sử dụng nguồn lợi từ cây chuyển gen, nhưng vẫn có
những lo lắng về độ an toàn với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến đa
dạng sinh vật.
Vì thế đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành theo hướng phát triển các
phương pháp chuyển gen không sử dụng gen chọn lọc hoặc loại bỏ các gen
chọn lọc. Bên cạnh việc giảm bớt những lo lắng của công chúng, việc vắng
mặt các gen chọn lọc trong cây chuyển gen đồng thời giảm chi phí trong việc
phát triển cây chuyển gen và thời gian cần thiết để đánh giá về an toàn và vì
thế sẽ thúc đẩy việc thương mại hóa các sản phẩm chuyển gen. Việc tạo ra
cây chuyển gen không mang gen chọn lọc còn tạo cơ hội cho việc chuyển
nhiều gen liên quan đến những tính trạng phức tạp như chống chịu với nhiều
loại bệnh và các tác nhân bất lợi của môi trường.
1.3.2. Các gen/hệ thống chọn lọc thân thiện
Trong công nghệ chuyển gen ở thực vật, các gen chỉ thị chọn lọc đóng
vai trò hết sức quan trọng cho sự chọn lọc nhanh cây chuyển gen từ những
mô, tế bào không chuyển gen. Các gen chỉ thị chọn lọc mã hoá cho các


17
protein liên quan dến sự chống chịu các tác nhân chọn lọc như kháng
sinh/thuốc diệt cỏ. Sau khi chuyển gen, dưới sự có mặt của các tác nhân chọn lọc,
các tế bào không mang gen chuyển có thể bị chết. Các gen chỉ thị chọn lọc
được phân chia thành hai loại: Các gen chỉ thị chọn lọc tích cực và không tích cực.
Phương thức chọn lọc tích cực là chọn lọc các tế bào chuyển gen có sinh

này, các tế bào chuyển gen sẽ sử dụng một số chất không độc hại mà trong
điều kiện bình thường không thể sử dụng. Thêm vào đó trong các chỉ thị chọn
lọc, có các chỉ thị chọn lọc tích cực an toàn có nguồn gốc cả từ thực vật và
không có nguồn gốc từ thực vật. Chi tiết một số chỉ thị chọn lọc tích cực an
toàn có/không nguồn gốc từ thực vật được trình bày Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số chỉ thị chọn lọc tích cực an toàn có/không nguồn gốc từ thực vật 49.
Gen
lac Z
Luc

Nguồn phân lập

dao1

Escherichia coli
Photinus pyralis
Rhodotorula
gracilis

dsdA

Escherichia coli

manA
kn1

Escherichia coli
Maize
Arabidopsis
thaliana


Cơ chất/tác nhân
chọn lọc

Tài liệu
tham
khảo

β-galactosidase
Luciferase

X-gal
Luciferin

32
55

D-amino acid oxidase
D-serine ammonia
lyase
hosphomannose
isomerase
Trehelose 6 phosphate
synthase

D-amino acids

24

D-serine

69

Mannitol

26

Acetolactate synthase
Betaine aldehyde
dehydrogenase

Imidazolinones

11

Betaine aldehyde

20

Xylose isomerase

D-xylose

28

N-acetyltransferase
Mannose 6 phosphate
reductase


19


20
tương tự với quá trình tổ hợp tại vị trí xác định. Hệ thống phổ biến được sử
dụng là Ac/Ds đươc phát hiện lần đầu tiên ở ngô. Tuy nhiên hướng này đòi
hỏi thời gian dài qua quá trình lai tạo và phân ly. Chi tiết một số hệ thống loại
bỏ chỉ thị chọn lọc từ cây chuyển gen được trình bày chi tiết bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số hệ thống loại bỏ chỉ thị chọn lọc từ cây chuyển gen 49.
Hệ thống

Phương pháp
chuyển gen

Co-transformation
Co-transformation
Ac/DS
Co-transformation
Co-transformation
R/RS
Cre/loxP (heat
inducible)
Cre/loxP
(chemically
regulated)
R/RS
Cre/loxP
Cre/loxP (chemical
regulated)
Co-transformation

Agrobacterium

16
67
78

Agrobacterium

Rice

hpt

70

Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium

nptII, 5-FC
nptII
nptII

40
19
88

Not known

82

Cre/loxP
Direct

Arabidopsis

hpt
gus
bar
nptII G418
ipt
nptII
hpt

43
37
86
12
14
48
76

Zea mays
Tomato
Tobacco

nptII
nptII
hpt

59
89
81


(Autoexcision)
Direct

Agrobacterium

R/RS
Co-transformation
Direct
Co-bombarded

Ovary drip in
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Biolistic

Cre/loxP

Agrobacterium

Cây trồng

Gen chỉ thị
chọn lọc


21

Cre/loxP

Cũng như các loài sinh vật khác, khi gặp các điều kiện bất lợi từ môi trường,
thực vật có khả năng sinh ra các cơ chế thích nghi khác nhau để có thể tồn tại,
sinh trưởng và phát triển. Cơ chế thường gặp nhất khi cây gặp các điều kiện
bất lợi về nước đó là tăng cường khả năng duy trì sức căng của các mô, tế bào
thông qua việc tăng cường tổng hợp các chất như các loại đường tan, các loại
axit amin,…để tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào. Glycine betain và
proline là hai trong số những chất trao đổi được quan tâm do hiện tượng tích
lũy rất mạnh của các hợp chất này khi cây gặp các điều kiện bất lợi từ môi
trường, đặc biệt là những yếu tố liên quan đến áp suất thẩm thấu nội bào.
Người ta cho rằng, có nhiều gen liên quan đến sinh tổng hợp Glycine
betaine như: CMO, BADH, codA từ những cơ thể sinh vật có khả năng tích
lũy GB một cách tự nhiên. Gen mã hóa cho CMO và BADH được phân lập từ
một số loài thực vật bậc cao 62. Trong đó gen codA được phân lập từ vi
khuẩn A. globiformis 29 mã hóa cho choline oxydase, là enzyme chìa khóa
có vai trò quan trọng trong phản ứng sinh tổng hợp GB. Từ đó, nhiều nhà
chọn tạo giống đã chú ý chuyển gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau.
Nhưng ứng dụng kĩ thuật chuyển gen để chuyển gen codA vào thực vật vẫn
đang còn là vấn đề mới mẻ chưa được nghiên cứu toàn diện.
1.4.1. Glycine betaine đối với tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi ở thực vật
Glycine betaine (GB) một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong
những chất hòa tan tương thích hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một


22
phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn và một số loài thực vật hạt kín
chịu hạn hán và chịu mặn 17. Trước đây GB đã được đề xuất, tăng tích lũy
các betaine trong các loài thực vật đóng một vai trò sinh lý quan trọng làm
giảm bớt căng thẳng thẩm thấu 80. GB bảo vệ cây bằng cách hoạt động
như một chất hữu cơ có ảnh hưởng đến thẩm thấu (osmolyte), duy tŕ cân
bằng nước giữa các tế bào thực vật và môi trường, ổn định các đại phân tử

5, 6.
Gen tp-codA là gen được cải biến từ gen codA phù hợp cho sự biểu hiện
ở thực vật. Ngoài ra, đầu 5’ trình tự gen codA tổng hợp nhân tạo được thiết
kế thêm một đoạn 216 nucleotide mã hóa đoạn peptide (Transite Peptide -TP)
giúp vận chuyển enzyme vào trong lục lạp và ở đầu 3’ là một đoạn 30
nucleotide mã hóa đoạn peptide (cmyc) giúp cho việc lai Western bot để kiểm
tra sự biểu hiện gen chuyển. Tổng chiều dài gen codA tổng hợp nhân tạo 1887
bp. Mặc dù trình tự nucleotide của gen codA tổng hợp (tp-codA) sai khác với
trình tự gốc có mã số AY304485 nhưng trình tự amino acid giống nhau
100%. 5, 6.
1.4.3. Các nghiên cứu chuyển gen codA nhằm tăng cường khả năng
chống chịu ở thực vật
Năm 1997, Hayashi và công sự đã chuyển gen codA phân lập từ vi
khuẩn A.globiformis vào cây Arabidopsis thaliana. Trong nghiên cứu này,
gen codA được thiết kế thêm đoạn peptide tín hiệu (transit peptide) dẫn vào
trong đích là lục lạp. Nồng độ GB được tích lũy trong lục lạp lên đến 50 – 100
mM. Kết quả thu được là hạt của cây chuyển gen có khả năng chịu được nồng
độ muối cao trong suốt quá trình nảy mầm và quá trình phát triển tiếp theo
của cây. Gen codA cũng được chuyển vào trong cây lúa và tích lũy GB ở lục
lạp, kết quả cho thấy cây lúa chuyển gen cũng có khả năng chịu mặn cao hơn
so với cây đối chứng. Tuy nhiên, khi không thiết kế thêm đoạn transit peptide
tín hiệu với mục đích biểu hiện gen codA trong tế bào chất thì lượng GB tích
lũy trong tế bào chất tăng lên từ 3 – 5 lần so với trong lục lạp. Từ kết quả này,
một số tác giả đưa ra giả thuyết rằng trong tế bào chất chứa lượng cơ chất là
choline cao hơn trong lục lạp, do đó, đây có thể là vị trí tổng hợp choline


24
trong tế bào. Khi các nhà khoa học tiếp tục kiểm tra cây Arabidopsis thaliana
chuyển gen codA trong các điều kiện bất lợi khác như: nhiệt độ thấp, nhiệt độ

có khả năng chống chịu tốt với điều kiện stress
Loài

Arabipopsis
thaliana
Arabipopsis
thaliana
Arabipopsis
thaliana
Arabipopsis
thaliana
Brassica
juncea
Diospyros
kaki
Euchlyptus
globulus
Oryza sativa
Oryza sativa
Solanum
lycopersicum
Solanum
lycopersicum
Solanum
lycopersicum
Melia
azedarach L.
Nicotiana
tabaccum


fw lá)
codA 2,0 µmol g-1 fw
cơ quan sản
xuất)
codA 0,9-1,43 µmol g1
fw lá)
codA

Diệp lục

codA

Tế bào chất Hạn, mặn

Diệp lục

Tài liệu
tham
khảo

Ánh sáng
10
mạnh
Lạnh, muối
29, 30

Diệp lục

Nhiệt



87
64
53

Diệp lục
/Tế bào
chất
Diệp lục

Lạnh,
muối, sự
57
oxi hóa
Sự oxi hóa,
8
muối
Tế bào chất Hạn
5
6
3