BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….  ….

HỒ THỊ ÁNH TUYẾT

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH
SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA
CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN
Bacillus thuringiensis var. israelensis
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 / 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….  ….

HỒ THỊ ÁNH TUYẾT

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH
SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA
CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN
Bacillus thuringiensis var. israelensis
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số

Điện thoại: (08) 38 999 866.
Email: [email protected]

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hồ Thị Ánh Tuyết

iii


Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cám ơn
-

Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh.

-

Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, các Giáo sư, Giảng viên và CBVC
phòng Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học.
Đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khoá học, tận tâm truyền đạt những kiến thức,
kinh nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành tôi theo học và nghiên cứu, cũng
như đã góp ý, chỉnh sửa đề tài, giúp đề tài được thực hiện tốt nhất.




TÓM TẮT
Đề tài: “Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế
phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) quy
mô phòng thí nghiệm” đã tiến hành tại phòng Kiểm nghiệm Công ty TNHH Sinh
học Mai Việt từ tháng 6/2008 đến tháng 8/2010.
Mục tiêu của đề tài là hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ A. aegypti từ qui trình
chuẩn nuôi muỗi tại Viện Pasteur; xác định liều gây chết LD50, LD90, LD99 của Bti
chuẩn và Bti thử; xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn
vị độc tố quốc tế trong 1 mg sinh phẩm (ITU/mg) và suy ra liều dự đoán của Bti thử
áp dụng diệt LQ muỗi ngoài thực địa.
Kết quả cho thấy từ qui trình chuẩn nuôi muỗi của Viện Pasteur có thể cung
cấp LQ cùng tuổi bằng cách lấy các băng giấy mà trứng muỗi đẻ cùng một ngày (24
giờ) nhúng chìm trong khay chứa nước cất hoặc nước không có clo ở 25 ± 20C.
Thức ăn của LQ là các mảnh protein như thức ăn chế biến sẵn cho cá, thỏ, gà. Cần
cho thức ăn vừa đủ để vi khuẩn không phát triển mạnh quá (giết chết lăng quăng).
Cho ăn nhiều lần cách quãng trong 1 - 2 ngày và quan sát mỗi ngày. Quần thể LQ
đồng nhất L3 hoặc L4 (5 ngày tuổi và dài 4 - 5 mm) được thu hoạch (tương ứng 6 7 ngày sau khi trứng nở).
Ở các liều gây nhiễm từ 4x10-2 mg/l đến 5x10-3 mg/l Bti chuẩn sau 24 giờ
phơi nhiễm có hoạt tính diệt LQ cao (trên 99%) ở tất cả các liều gây nhiễm. Đối
với Bti thử, tỷ lệ LQ chết tương ứng giảm dần từ 98,99% xuống 6,12% nên kết
quả được xử lý để tính các giá trị LD 50, LD90, LD99 của Bti thử. Ở liều gây nhiễm
Bti chuẩn từ 4x10-3 mg/l đến 5x10-4 mg/l có tỷ lệ chết tương ứng giảm dần từ
94,91 % xuống 13,90 % nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD 50, LD90 .
Trong khi đó Bti thử có tỷ lệ LQ chết dưới 5% nên kết quả không được sử dụng để
tính các giá trị LD50, LD90 . Tương tự ở liều 4x10-4 mg/l đến 5x10-5 mg/l của Bti

v


mosquito eggs laid on the same day (24 hours) in a tray of distilled water or
chlorineless water at 25 ± 20C.
The food for mosquito larvae was protein fragments, such as processed food
for fish, rabbits, and chickens. It was important to provide just enough food so that
the bacteria would not develop too fast (and kill the mosquito larvae). The larvae
were fed many times a day at regular intervals, for 1-2 days, and observed daily.
Homogeneous populations of mosquito larvae L3 or L4 (5-day-old and 4-5 mm
long) were collected (6-7 days respectively after hatching).
After 24 hours of exposure, all infected doses from 4x10-2 mg/l to 5x10-3
mg/l of standard Bti showed high activities in killing mosquito larvae (over 99%).
As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae gradually
declined from 98,99% to 6,12%. The results were subsequently processed to
calculate the value of lethal doses LD50, LD90, LD99 of sampling Bti. With standard
Bti infected doses from 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l, the death rates of mosquito

vii


larvae decreased from 94,91% to 13,90%, so the results were processed to calculate
the value of LD50, LD90. As for sampling Bti, the corresponding death rates of
mosquito larvae were under 5%, so the results were not used to calculate the value
of LD50, LD90. Similarly, with doses of 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l of both
standardized Bti and sampling Bti, the death rates of mosquito larvae were under
5%. The project as such established a process for testing Bti efficacy consisting of 3
basic steps: 1) selecting mosquito larvae used in experimental tests of Bti products,
based on definite criteria 2) infecting mosquito larvae with Bti to determine its level
of biological activity in killing mosquito larvae LD50, LD90, LD99 in experiments. 3)
determining the mosquito larvae killing efficacy of Bti biological products in terms
of international toxic units, and deriving predicted doses of Bti applied to kill
mosquito larvae in field tests.

2.2.1. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti trên thế giới ........................................13
2.2.2. Sử dụng Bti tại Việt Nam.............................................................................16
2.3. Tình hình nghiên cứu Bti tại Việt Nam ...........................................................16
2.4. Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti ...............................................17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18
3.1. Thời gian và địa điểm .....................................................................................18
3.1.1. Thời gian .....................................................................................................18

ix


3.1.2. Địa điểm ......................................................................................................18
3.2. Vật liệu và trang thiết bị .................................................................................18
3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................18
3.2.2. Trang thiết bị ............................................................................................... 20
3.3. Nội dung .........................................................................................................21
3.4. Mô tả thí nghiệm ............................................................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 29
4.1. Kết quả ...........................................................................................................29
4.1.1. Tiêu chuẩn chọn LQ (LQ) A. aegypti dùng trong thí nghiệm........................ 29
4.1.2 Tỉ lệ LQ hoá nhộng sau 24 giờ phơi nhiễm Bti chuẩn và Bti thử...................35
4.1.3. Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ và tính tỷ lệ LQ chết sau 24 giờ phơi nhiễm
ứng với các liều của sản phẩm Bti chuẩn và Bti thử ....................................37
4.1.4 Xác định các liều chết LD50, LD90, LD99 của Bti trong thí nghiệm ...............41
4.1.5 Cách tính công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố
quốc tế (ITU/mg) và xác định liều dự đoán của Bti thử để áp dụng thử
nghiệm diệt LQ muỗi trên thực địa ............................................................. 47
4.2. Một số nhận xét và bàn luận ...........................................................................48
Chương 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 51
5.1. Kết luận ..........................................................................................................51

Biểu đồ 2.1. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2004)..............13
Biểu đồ 2.2. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2005)..............14
Hình 2.5. Trực thăng rải Bti ..................................................................................14
Hình 2.6. Các vùng ngập sau tuyết tan vào mùa xuân và vùng nước đọng vào mùa
hè được chọn để dùng Bti ở Norfolk. ....................................................... 15
Hình 3.1. Chế phẩm Bti MOSQUITO BITS.......................................................... 19
Hình 3.2. Chế phẩm vi sinh Bti TN06 sản xuất tại Công ty TNHH SH Mai Việt...20
Hình 4.1 Nuôi muỗi tại Phòng Côn trùng y học viện Pasteur Tp HCM .................30
Hình 4.2 Nuôi LQ thí nghiệm Bti theo quy trình của Viện Pastuer........................ 31
Hình 4.3 Quần thể LQ không đồng đều về tuổi ....................................................31
Hình 4.4 Băng giấy có trứng muỗi chuẩn bị ngâm nước cho ấp nở thu LQ............32
Hình 4.5 Băng giấy có trứng muỗi ngâm nước cho ấp nở thu LQ.......................... 32
Hình 4.6 Chọn LQ làm thí nghiệm .......................................................................33
Hình 4.7 Quần thể LQ A. aegypti .........................................................................34
Hình 4.8 LQ A. aegypti phân theo theo tuổi (L1: LQ tuổi 1; L2: LQ tuổi 2; L3:
LQ tuổi 3; L4: LQ tuổi 4).........................................................................35
Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ
4x10-2 – 5x10-3 mg/l (lần 1).....................................................................42
Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ
4x10-2 – 5x10-3 mg/l (lần 2).....................................................................43
Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ
4x10-2 – 5x10-3 mg/l (lần 3).....................................................................44

xii


Biểu đồ 4.4. Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ
4x10-3 – 5x 10-4 mg/l (lần 1)...................................................................45
Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ
4x10-3 – 5x 10-4 mg/l (lần 2) .....................................................................46

năm trước. Trong thời gian này sốt Dengue chỉ được xem là bệnh nhẹ. Một vụ đại
dịch sốt Dengue xuất hiện ở Đông Nam Á sau Chiến tranh thế giới thứ II và từ đó
lan rộng trên toàn cầu. Cũng ở khu vực Đông Nam Á, sốt Dengue lần đầu tiên được
phát hiện ở Philippines vào năm 1950, đến năm 1970 bệnh đã trở thành nguyên
nhân nhập viện và tử vong thường gặp ở trẻ em trong vùng này.
Tỷ lệ mắc bệnh trên toàn thế giới đã gia tăng mạnh trong những năm gần
đây. Bệnh này hiện đã trở thành dịch tại trên 100 quốc gia ở châu Phi, châu Mỹ, khu
vực phía Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Đông Nam
Á và Tây Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Trước năm
1970, chỉ có 9 quốc gia có dịch lưu hành; con số này tăng lên gấp hơn 4 lần vào
năm 1995; không chỉ số trường hợp mắc bệnh gia tăng mà khả năng nhiễm nhiều
loại vi rút khác nhau cũng ngày càng đáng báo động. Trong vụ dịch, tỷ lệ mắc bệnh
ở những đối tượng nhạy cảm thường là 40 – 50% nhưng cũng có thể ở mức 80 –
90%.
Sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh nhiễm trùng hàng đầu ở trẻ
1


em khiến trẻ nhập viện và tử vong cao ở các vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình
Dương trong những thập kỷ qua. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm,
có trên 50 triệu người nhiễm vi rút Dengue trên toàn thế giới trong đó có hơn
500.000 bệnh nhân cần phải nhập viện. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ
bệnh nhân sốt xuất huyết cao trong khu vực, phần lớn trong số đó là trẻ em. Tỷ lệ tử
vong chung vào khoảng 2,5%. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh sốt xuất huyết
gia tăng hàng năm, trong 5 năm gần đây dịch sốt Dengue chưa bao giờ giảm trên
hầu hết các tỉnh phía Nam, và đang tăng cao trở lại tại Hà Nội. Mới đây, Sở Y tế
tỉnh Khánh Hoà cho biết sốt xuất huyết trên địa bàn tỉnh ngày càng gia tăng. Ngày
16/7/2010, Khánh Hoà đã công bố dịch sốt xuất huyết trên toàn tỉnh. Sau 2 tuần
công bố dịch, toàn Khánh Hoà đã có gần 3.000 trường hợp mắc bệnh. Trung bình
mỗi tuần có thêm 265 trường hợp sốt xuất huyết, cao gấp đôi năm 2009 (Báo Công

trong khâu đánh giá công hiệu giúp cải tiến, nâng cao chất lượng để ra được sản
phẩm tương đương nhập ngoại.
“Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế phẩm
sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis quy mô phòng thí
nghiệm” chính là đề tài chúng tôi mong muốn thực hiện, nhằm có được một quy
trình kiểm định Bti tại cơ sở đáp ứng nhu cầu thực tế trên, và có thể nhanh chóng
biết được công hiệu sản phẩm qua các loạt sản xuất, từ đó cải tiến nâng cao chất
lượng sản xuất độc tố của Bti trong sản phẩm.
Đề tài được thực hiện với sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học
trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. BS. Hồ
Thị Hồng Nhung, Trưởng Phòng thí nghiệm Gốc giống và sinh phẩm chẩn đoán,
Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
1.2. Mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể
1.2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu xây dựng quy trình kiểm định công hiệu của chế phẩm sinh học
Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) áp dụng kiểm tra hoạt tính sinh học diệt

3


LQ ở phòng thí nghiệm cơ sở tại Việt Nam.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
1. Hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ từ qui trình chuẩn nuôi muỗi A. aegypti tại
Viện Pasteur nhằm phục vụ cho thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti.
2. Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ A. aegypti để xác định liều chết LD50, LD90,
LD90 của Bti.
3. Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc
tế trong 1 mg sinh phẩm (ITU/mg) và suy ra liều dự đoán của Bti áp dụng
diệt LQ muỗi trong thử nghiệm thực địa.


đến 300 trứng cùng một thời gian. Mỗi loại muỗi khác nhau có các tập tính đẻ trứng
khác nhau trong môi trường sống. Muỗi vằn Culex và Culiseta, trứng đẻ ra kết
thành từng khối hàng trăm trứng trong khi Anopheles và Aedes trứng được đẻ riêng
rẽ. Culex, Culiseta và Anopheles đẻ trứng trên mặt nước trong khi Aedes đẻ trứng
trên đất ẩm ướt sẽ ngập nước. Hầu hết trứng nở thành ấu trùng trong vòng 48 giờ.
Giai đoạn trứng là 2 – 3 ngày.

Hình 2.1 Một số loại LQ muỗi
-

Ấu trùng (lăng quăng) có 4 tuổi tính từ lúc trứng nở đến lúc hoá nhộng gọi là

L1, L2, L3 và L4 (L: larvar), LQ sống trong nước từ khoảng 5 – 10 ngày tùy thuộc
nhiệt độ, môi trường. Giai đoạn ấu trùng tăng trưởng rất nhanh sau mỗi lần lột xác;

6


sau lần lột xác thứ 4, chúng trở thành nhộng và không ăn. Hầu hết các ấu trùng đều
có 1 ống thở (siphon) được treo trên mặt nước để lấy oxy trong không khí, riêng
Anopheles ấu trùng không có ống thở và vì thế chúng nằm song song với mặt nước.

1 : Trứng muỗi

2 : LQ tuổi 1 (L1)

3. : LQ tuổi 2 (L2)

4 : LQ tuổi 3 (L3)


Culex, và Culiseta. trong đó ở Việt Nam muỗi A. aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết
Dengue và Anopheles truyền bệnh sốt rét
2.1.3. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis H 14
2.1.3.1. Lịch sử phát hiện ra Bti
Trong 2 năm 1975 - 1976, đã có một dự án do WHO tài trợ nghiên cứu các
tác nhân ký sinh trùng và gây bệnh trên loài muỗi ở Israel. Suốt quá trình giám sát
này, một chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) mới được phát hiện có tính độc
cao với LQ muỗi (Goldberg và Margalit 1977, được trích dẫn bởi Glare và
O’Callaghan, 1998), sau đó được định danh là B.thuringiensis var. israelensis, tuýp
huyết thanh (serotype) H14 (Bti) (de Barjac 1978 được trích dẫn bởi Glare và
O’Callaghan, 1998). Tại thời điểm được biết đến, chủng Bti này cho thấy có độc
tính cao với LQ hơn các chủng vi khuẩn đã biết khác. Bti được phân lập tại vùng sa
mạc Negev của Israel. Các nghiên cứu về độc tính của Bti nhanh chóng được
nghiên cứu và phát triển, người ta đã biết về tính độc giới hạn trong phạm vi các
loài muỗi và ruồi đen (blackfly). Từ đó Bti được xem xét về tiềm năng để phát triển
thành thương phẩm diệt LQ muỗi dùng trên toàn thế giới. Nhanh chóng ngay sau
đó, rất nhiều các sản phẩm Bti đã có mặt trong thập niên 1980. Các giám sát hoá
chất diệt muỗi đã cho thấy một số hoá chất phun diệt tỏ ra bị đề kháng, cùng với

8


việc phải luôn tìm ra hoá chất mới, sự cần thiết của Bti càng cấp bách và được
WHO khuyến khích dùng mạnh mẽ
Phân loại B.thuringiensis var. israelensis:
Giới

Bacteria;

Ngành

chủng Bti sản xuất một hoặc nhiều loại protein bên trong vi khuẩn thường gọi là các
protein tinh thể diệt côn trùng hay là các delta endotoxin. Đặc tính sinh deltaendotoxins (Cry) hầu hết nằm trên các plasmid. Các protein giống như ở dạng kết
tinh này có tính độc đặc hiệu với các nhóm côn trùng bộ 2 cánh (Diptera).
Phương pháp định danh Bti dựa trên tuýp huyết thanh học, hình dạng các
tinh thể độc tố Cry và các thử nghiệm sinh hoá. Dựa trên kháng huyết thanh lông
(flagellar kháng nguyên H) khác nhau người ta phân biệt được có hơn 60 tuýp huyết
thanh Bti (Glare và O'Callaghan, 1998). Quan trọng nhất là serovar H14, đặc tính
của từng serovar H nằm trên nhiễm sắc thể, nhưng khả năng sinh độc tố là nằm trên
plasmid.

9


Hình 2.3. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis: Nha bào tế bào và
độc tố Cry (Glare và O'Callaghan, 1998)
2.1.3. 3. Cơ chế diệt LQ muỗi của Bti
Vi khuẩn Bti sản xuất ra 4 nhóm tinh thể nội độc tố (protein Cry) chính diệt
LQ (27, 65. 128 và 135 kDa). Các Cry của Bti quan trọng là: Cry4B, Cry4A,
Cry11Aa và Cyt1Aa, theo xếp loại mới nhất Cry4 và Cyt đặc hiệu với côn trùng 2
cánh. Các protein tinh thể được hình thành ở điểm cuối nha bào (cận nha bào). Tất
cả các protein đều độc với muỗi, tuy nhiên nếu có đầy đủ và tương tác của các
protein Cyt Aa và Cry4, Cry11 sẽ tạo ra độc tính mạnh hơn (Glare and O'Callaghan,
1998).
Bào tử và các tinh thể nội độc tố được sinh ra ra trong quá trình sinh trưởng,
phát triển của Bti. Chúng xâm nhập vào ống tiêu hoá của LQ qua đường thức ăn,
sau khi vào ống tiêu hoá, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan trong môi trường kiềm
của ruột giữa LQ (là các tế bào biểu mô trụ giữa), sau đó được các proteolytic hoạt
hoá, các tinh thể độc tố này gắn vào thụ thể trên vách tế bào ống ruột giữa LQ, kết
quả là tạo ra các lỗ thủng trên tế bào ruột giữa, dịch ruột giữa của LQ sẽ tràn vào
xoang cơ thể LQ làm mất cân bằng ion trong máu LQ và LQ chết (hình 2.4)