BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

******************

TƠN TRANG ÁNH

NI CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CÂY GẤC
(Momordica cochinchinensis L. Spreng)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 9/2010

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

******************

TƠN TRANG ÁNH

NI CẤY MƠ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CÂY GẤC
(Momordica cochinchinensis L. Spreng)

Chun ngành : Trồng trọt
Mã số

ThànhTRANG
phố HồÁNH
Chí Minh
Tháng 9/2010

iii


Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS.TS. LÊ QUANG HƯNG
Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

2. Thư ký:

TS. VÕ THÁI DÂN
Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

3. Phản biện 1:

TS. NGUYỄN HỮU HỔ
Viện Sinh Học Nhiệt Đới

4. Phản biện 2:

TS. BÙI MINH TRÍ
Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

5. Ủy viên:

Điện thoại: Cơ quan:
Nhà riêng:
Mobil.

08. 37220295
08. 62597786
0986970375

Email:

v


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôn Trang Ánh

vi


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:
● Ban Giám Hiệu, phòng Sau Đại Học trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt khóa học.
● Quí thầy cô tham gia giảng dạy lớp Cao học Trồng trọt 2006, đã giảng dạy, truyền
đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quí báu.
● Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

lượng tươi (5,18gr), chất lượng sẹo tốt sau 6 tuần nuôi cấy).
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng đến
quá trình hình thành chồi của cây gấc in vitro gồm 13 nghiệm thức là 13 loại môi
trường có thành phần cơ bản là MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (0 –
2 mg l-1), và Kn (0 – 2 mg l-1) phối hợp với NAA (0 – 0,2 mg l-1). Kết quả đạt được: môi
trường có bổ sung BA 2,0 mg l-1 phối hợp với NAA 0,2 mg l-1 cho số chồi cao nhất
(16,0 chồi), số lá nhiều nhất (5,55 lá) và cây sinh trưởng phát triển tốt sau 6 tuần
nuôi cấy.
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng đến
quá trình ra rễ của cây gấc in vitro gồm 8 nghiệm thức là 8 loại môi trường có thành
phần

viii


cơ bản là MS và ½ MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng NAA (0,5 – 1,5 mg l-1).
Kết quả đạt được: môi trường ½ MS bổ sung NAA (0,5 mg l-1) cho số rễ (8,15 rễ)
và chiều dài cao nhất (75,78 mm) sau 8 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết từ cây gấc, thí
nghiệm gồm 8 nghiệm thức là những dịch chiết các bộ phận như thân, lá, rễ của cây
ngoaì tự nhiên, cây in vitro, mô sẹo và đối chứng là dung môi ethanol. Kết quả đạt
được: dịch chiết rễ gấc ngoài tự nhiên có hoạt tính kháng mạnh nhất trên cả ba
chủng vi khuẩn thử nghiệm so với các nghiệm thức còn lại.
Thí nghiệm xác định thành phần hoá thực vật có trong cao chiết kháng khuẩn
mạnh nhất. Sau khi phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của rễ cây ngoài tự
nhiên Kết quả đạt được: trong rễ cây gấc ngoài tự nhiên tồn tại một số hợp chất:
acid hữu cơ, alkaloid, đường khử, polyuronic, saponin, tinh dầu, saponin
triterpenoid; kết hợp các phản ứng sinh hóa và sắc ký lớp mỏng cho kết quả:
saponin triterpenoid là chất chính trong rễ gấc ngoài tự nhiên.
Đề tài này đã xây dựng được qui trình nhân giống in vitro cây gấc có thể áp

to be the effective medium for root generation in the period of 8 weeks.
Investigation of antibacterial activity of sweet gourd extracts was carried out
in 8 treatments with extracts from different parts of both field-grown and in vitro
plants such as stem, leaf, root, calli (in case of in vitro plants), and ethanol as the
control. The obtained results showed that root extract from field-grown sweet gourd
had the highest antimicrobial activity on three tested strains of bacteria.

vii


Identification of chemical components contained in the root extract from
field-grown plant was performed, which showed the existence of organic acids,
alkaloid, polyuronic, saponine, fine oil and saponin triterpenoid. Additionally,
biochemical tests and thin layer chromatography have revealed that saponin
triterpenoid is the main chemical content in roots of sweet gourd in natural
conditions.
Eventually, the protocol for in vitro propagation of sweet gourd was
achieved, which can be applied in rapid multiplication for large-scale production of
sweet gourd. Moreover, the identification of plant part and the chemical content
which contribute to the activity against microbes of field-grown sweet gourd is
applicable in futher researches on extraction and purification of natural substances
for human therapies.

viii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG


2.1.5.2 Hạt gấc .......................................................................................................... 11
2.1.5.3 Rễ gấc ............................................................................................................ 11
2.1.5.4 Thân và lá gấc ............................................................................................... 12
2.2 Tình hình nghiên cứu về cây gấc ........................................................................ 12
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy in vitro ..................................................... 13
2.3.1 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thực vật ................................ 13
2.3.1.1 Auxin ............................................................................................................. 13
2.3.1.2 Cytokinin .................................................................................................... 15
2.3.2 Ảnh hưởng của agar và độ pH ......................................................................... 18
2.3.3 Ảnh hưởng của đường ..................................................................................... 18
2.3.4 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng và vi lượng .................................................. 18
2.3.5 Ảnh hưởng của vitamin .................................................................................... 19
2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý ................................................................ 20
2.4 Nhân giống in vitro cây gấc ................................................................................ 20
2.5 Các nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro cây họ bầu bí ......................... 21
2.6 Một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ........................................................................ 22
2.6.1 Alkaloid ............................................................................................................ 22
2.6.2 Flavonoid.......................................................................................................... 22
2.6.3 Saponin .................................................................................................. 23
2.7 Sơ lược đặc tính của các vi khuẩn thử nghiệm ................................................... 24
2.7.1 Escherichia coli (E.coli)................................................................................... 24
2.7.2 Salmonella typhimurium .................................................................................. 25
2.7.3 Staphylococus aureus ............................................................................. 26
2.8 Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của thực vật................................. 26
2.9 Giới thiệu về sắc ký lớp mỏng ............................................................................ 28
Chương 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................... 33
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................... 33
3.2 Nội dung ............................................................................................................. 33
3.2.1 Nội dung 1 ........................................................................................................ 33

BA và Kinetin đến quá trình hình thành chồi của cây gấc in vitro ................ 56
4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
NAA đến quá trình ra rễ của cây gấc in vitro ........................................................... 63

xi


4.2 Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và xác định thành phần
hoá thực vật có trong cao chiết có tác dụng kháng khuẩn ....................................... 66
4.2.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thô
từ cây gấc................................................................................................................................ 66
4.2.1.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ cây gấc
ngoài tự nhiên ............................................................................................................ 66
4.2.1.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ, mô sẹo cây gấc in vitro ........ 69
4.2.2 Thành phần hóa thực vật trong dịch chiết của rễ gấc ngoài tự nhiên............... 73
4.2.2.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của rễ gấc ngoài tự nhiên ............ 73
4.2.2.2 Phân tích xác định hợp chất saponin trong rễ gấc
ngoài tự nhiên bằng phản ứng hóa học ..................................................................... 80
4.2.2.4 Định tính hợp chất saponin toàn phần trong rễ gấc ngoài tự nhiên
bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ................................................................................. 81
Chương 5. Kết luận và đề nghị .............................................................................. 83
5.1 Kết luận ............................................................................................................... 83
5.1.1 Nuôi cấy mô cây gấc ........................................................................................ 83
5.1.2 Các loại dịch chiết thô từ các bộ phận của cây gấc
có tác dụng kháng khuẩn ........................................................................................... 83
5.1.3 Thành phần hóa thực vật trong dịch chiết kháng khuẩn mạnh nhất ................ 84
5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 84
Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 84
Phụ lục


Indole – 3 acetic acid

IBA

Indole – 3 butyric acid

Kn

Kinetine

Mea

Melastoma affine

MeOH

Methanol

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA

α – Napthalene acetic acid


Ultraviolet Radiation

2,4-D

2,4 – dichlorophenoxyacetic acid

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của khô bã gấc ........................................................ 10
Bảng 2.2 Thành phần axit béo của dầu màng gấc ......................................................... 11
Bảng 3.1 Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng 2,4D, BA, NAA sử dụng
trong tạo sẹo cây gấc in vitro ....................................................................................... 36
Bảng 3.2. Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BA, Kn và NAA sử dụng
trong tạo chồi cây gấc in vitro......................................................................................................................... 38
Bảng 3.3. Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA sử dụng trong tạo rễ
của cây gấc in vitro ....................................................................................................... 39
Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến việc tạo sẹo
cây gấc in vitro ................................................................................................................ 51
Bảng 4.2 Chồi gấc sau 4 và 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng ............................................................................................................ 57
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA đến khả năng
tạo rễ của cây gấc in vitro sau 4 và 8 tuần nuôi cấy.............................................................. 63
Bảng 4.4 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ
cây gấc ngoài tự nhiên .......................................................................................................... 66
Bảng 4.5 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết từ lá, thân, rễ, mô sẹo
cây gấc in vitro ............................................................................................................... 69
Bảng 4.6 Kết quả phân tích định tính thành phần hóa thực vật trong rễ
gấc ngoài tự nhiên .......................................................................................................... 73


xiii


Hình 4.12 Vòng vô khuẩn của dịch chiết thân gấc in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 70
Hình 4.13 Vòng vô khuẩn của dịch chiết rễ gấc in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 71
Hình 4.14 Vòng vô khuẩn của dịch chiết mô sẹo in vitro trên ba chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................................. 71
Hình 4.15 Biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn ............................................ 72
Hình 4.16 Phản ứng định tính acid hữu cơ ............................................................... 75
Hình 4.17 Phản ứng định tính alkaloid ..................................................................... 75
Hình 4.18 Phản ứng định tính anthraglycosid........................................................... 76
Hình 4.19 Phản ứng định tính carotenoid ................................................................. 76
Hình 4.20 Phản ứng định tính chất béo ..................................................................... 77
Hình 4.21 Phản ứng định tính đường khử ................................................................. 77
Hình 4.22 Thí nghiệm định tính coumarin ................................................................ 78
Hình 4.23 Phản ứng định tính flavonoid ................................................................... 78
Hình 4.24 Phản ứng định tính polyuronic ................................................................. 79
Hình 4.25 Phản ứng định tính saponin ...................................................................... 79
Hình 4.26 Phản ứng định tính saponin triterpen ....................................................... 80
Hình 4.27 Phản ứng tạo bọt Phản ứng Liebermann – burchard
Phản ứng Fontan-Kaudel........................................................................................... 81
Hình 4.29 Sắc đồ saponin triterpen trong rễ gấc ngoài tự nhiên............................... 81

1


Chương 1

vùng Đông Bắc Bộ, Duyên Hải miền Trung và vùng Đông Nam Bộ với qui mô
nhỏ.
Hiện nay, cây gấc đã được qui hoạch trồng trên diện rộng ở các tỉnh phía Bắc
như Hưng Yên, Hải Dương có sự hỗ trợ về kỹ thuật và bao tiêu sản phẩm của
một số công ty như VnpoFood, Nuga.
Gấc có thể được trồng bằng hạt hoặc giâm cành, tuy nhiên nếu trồng
bằng hạt tỉ lệ phân ly đực, cái rất cao (50-70%), thời gian nảy mầm lâu và hệ số
nhân giống thấp. Phương pháp nhân giống gấc được áp dụng phổ biến hiện nay
là trồng bằng hom. Ưu điểm của phương pháp này là nhân giống nhanh hơn
trồng bằng hạt, tuy nhiên cành giâm khó ra rễ, yêu cầu kỹ thuật cao và cành
giâm rất dễ bị thối nếu trồng vào mùa mưa. Vì vậy, nhân giống cây bằng
phương pháp nuôi cấy mô sẽ khắc phục được các nhược điểm của hai phương
pháp nhân giống trên, với hệ số nhân giống cao, nuôi cấy mô cây gấc sẽ cho số
lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Do đó, nếu chọn được một giống gấc
tốt thì nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống đồng loạt, phục tráng giống, từ
đó nhân rộng và cung cấp cho sản xuất.
Nhận thấy rõ vai trò của cây gấc trong đời sống con người và để khắc phục
được các nhược điểm trong công tác nhân giống cây trồng, đề tài: “Nuôi cấy
mô và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây gấc (Momordica
cochinchinensis L. Spreng)” được thực hiện
1.2. Mục tiêu
- Xác định nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng tối ưu cho quá trình nuôi cấy
mô cây gấc
- Xác định loại dịch chiết thô từ các bộ phận của cây gấc có tác dụng kháng
khuẩn
- Xác định thành phần hoá thực vật trong dịch chiết kháng khuẩn mạnh nhất
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3


Ánh sáng: cây gấc là cây ưa ánh sáng ngày ngắn, ưa khí hậu ấm áp và ẩm độ cao.
Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện cường độ chiếu sáng mạnh nhưng quả phát triển
tốt trong điều kiện chiếu sáng giảm. Giai đoạn quả đang lớn nếu gặp ánh sáng chiếu
trực tiếp quả rất dễ bị rám, thối hoặc sớm rụng. Chính vì vậy, trồng gấc tốt nhất nên
làm giàn để nâng cao chất lượng cũng như phẩm chất quả.

4


- Nhiệt độ: nhiệt độ trung bình cho gấc phát triển là từ 25 – 27OC, hạt gấc có thể nảy
mầm ở nhiệt độ 13 – 15 OC , nhưng tốt nhất ở 25 OC.
- Ẩm độ: gấc là cây có khả năng chịu được hạn tốt hơn chịu được úng. Giai đoạn từ
khi mới trồng đến trước khi ra hoa yêu cầu độ ẩm đất đạt 65 – 70%. Giai đoạn ra
hoa kết quả yêu cầu độ ẩm đạt 75%. Gấc là cây chịu úng rất kém, vì vậy khi trồng
tốt nhất nên làm vồng, ụ hay trồng ở nơi có khả năng tiêu thoát nước tốt.
Cây gấc cần nước nhiều nhất ở giai đoạn ra hoa và phát triển trái. Thiếu nước trong
giai đoạn này sẽ làm hoa rụng, trái phát triển kém, năng suất thấp.
- Cao độ: gấc có thể phân bố ở độ cao từ 0 đến 1500m so với mặt nước biển. Để gấc
cho nhiều quả nhất thiết phải làm giàn, càng có điều kiện vươn xa và ánh sáng mặt
trời thì gấc càng cho nhiều quả.
2.1.4 Đặc tính thực vật học
- Thân: gấc là cây thân thảo, dây leo, đa niên, đơn tính biệt chu, có tua cuốn ở nách
lá, thân cây có tiết diện góc và chiều dài thân có thể lên đến 15 m. Thân lá gấc có
mùi hôi nên ít bị sinh vật khác phá hoại, có khả năng thích nghi với mọi địa hình và
có thể trồng gấc trên nhiều loại đất khác nhau.
- Lá: lá gấc mọc so le, nhẵn, có màu xanh biếc, to bằng bàn tay và xòe kiểu chân vịt.
Phiến lá xẻ 3 -5 thùy, dài 8 - 18 cm, chia thuỳ khía sâu tới 1/3 hay 1/2 phiến lá.
- Hoa: mùa hoa tháng 4 - 5, cánh hoa màu vàng nhạt, sắc hoa tươi. Hoa đực, hoa cái
riêng biệt, mọc riêng rẽ ở nách lá, cánh hoa màu vàng nhạt, đài sắc xanh. Hoa đực
và hoa cái có thể mọc trên cùng một dây, cũng có khi cây chỉ có hoa đực hoặc chỉ

ung thư gan, xơ gan và phòng bệnh mạn tính, kéo dài tuổi thọ nhờ các chất có tác
dụng quét loại các gốc tự do, gốc peroxyd trong cơ thể. Ngoài ra, gấc còn giúp cho
trẻ em phát triển sớm về trí tuệ và thể lực nhờ vitamin E và lycopen cùng với lutein,
zeaxanthin, beta cryptoxanthin trong quả gấc ở dạng thiên nhiên. Khi phân tích giá
trị dinh dưỡng của màng hạt gấc, nhóm nghiên cứu Vương Lệ Thuý và cộng sự của
trường Đại học Hawaii (2005) báo cáo rằng hàm lượng carotenoid tổng số trung
bình là 497,4 μg/g chất tươi và α -tocopherol là 76,3 μg/g chất tươi.

6


2.1.5.1 Màng hạt gấc: màng của hạt gấc có hàm lượng lycopen là 380 mg/g, cao
gấp 10 lần nồng độ của các loại trái cây và rau quả được xem là nguồn giàu
lycopen.
Khi ép màng đỏ hạt gấc sấy khô được sản phẩm dầu gấc màu đỏ sẫm, sánh, trong,
vị béo, mùi thơm đặc trưng, 100g dầu có trên 1446mg carotenoid, 422mg β-caroten,
138,5mg α – tocopherol và 364,8mg lycopen. Các carotenoid (gồm chủ yếu: β –
caroten, lycopen) có mặt trong gấc liên kết với các axit béo mạch dài làm cho nó có
tính hoạt hóa sinh học cao hơn. Thành phần carotenoid có trong gấc phụ thuộc rất
nhiều vào giống, đất trồng với hàm lượng dao động 3.768,3-7.516µg/g.
Carotenoid: là những hợp chất tetratecpen, có màu từ vàng đến đỏ, phổ biến trong
các loại rau quả, cây xanh với hơn 600 các thành phần polyisoprenoid khác nhau ở
các dạng đồng phân cis hoặc trans. Các hợp chất của carotenoid như: caroten,
lycopen, xantophyl trong đó caroten chiếm một vị trí quan trọng.
Carotenoid có nhiều trong các loại rau và các loại quả, là hợp chất có khả năng
chống oxi hoá rất mạnh. Carotenoid là nhóm tiền sinh tố A đối với động vật có vú,
giữ chức năng sinh học rất quan trọng trong quá trình phát triển cơ thể. Tác động
chủ yếu của carotenoid không phải là tham gia quá trình oxi hoá, oxi hoá khử, mà là
trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức phận của màng
tế bào và tăng sự đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể. Chính vì vậy mà carotenoid