TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-----------------------

NGUYỄN THỊ NA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-----------------------

NGUYỄN THỊ NA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học:

TS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Na


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................ 2
NỘI DUNG ........................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Một vài đặc điểm của CVK .......................................................................... 4
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK .......................................................................... 4
1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ................................................................. 4
1.1.3. Cấu trúc của màng CVK ............................................................................. 5
1.1.4. Một số đặc tính của màng CVK................................................................... 5
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK...................................................................................... 6
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng CVK .................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc
8
1.2.1. Trên thế giới ................................................................................................ 8
1.2.2. Tại Việt Nam................................................................................................ 9
1.3. Tổng quan về neomycin .............................................................................. 10
1.3.1. Công thức .................................................................................................. 10
1.3.2. Tính chất lí hóa ......................................................................................... 10
1.3.3. Dược lí và dược động học.......................................................................... 11


Cellulose vi khuẩn

Cs:

Cộng sự

ĐHSP:

Đại học sư phạm

KTNN:

Kỹ thuật nông nghiệp

PBS:

Phosphate buffered saline

NCKH&CGCN:

Nghiên cứu Khoa học và ứng dụng

Nxb:

Nhà xuất bản

mht:

Khối lượng thuốc hấp thụ

nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ
phẩm,...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK được tạo nên từ các nguyên
liệu dẻ tiền, dễ kiếm như nước vo gạo, nước dừa già...,và có thể sản xuất trên quy
mô công nghiệp. Về mặt tính chất CVK có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với
các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định
về kích thước và hướng. CVK còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ
nước rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề
mặt (lực bền cơ học cao).
Ngày nay, khi môi trường ngày càng bị ô nhiễm thì vấn đề về da cũng xuất
hiện nhiều hơn, như các bệnh viêm da do dị ứng hay viêm da do nhiễm trùng. Để
điều trị bệnh này thì thường có nhiều loại thuốc khác nhau trong đó có Neomycin.
Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương. Tuy
nhiên, những phát hiện gần đây cho thấy rằng kem Neomycin thông thường có một
số nhược điểm trong phương pháp điều trị như khả năng thẩm thấu qua da không
cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1].
Để tăng sự hấp thụ của thuốc đồng thời giảm tác dụng không mong muốn
của thuốc, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng hấp
thụ thuốc Neomycin của màng cellulose vi khuẩn từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu: khả năng hấp thụ của thuốc của màng CVK, tìm điều kiện để
màng hấp thụ thuốc được nhiều nhất.
1


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc neomycin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Một vài đặc điểm của CVK

1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
- Màng CVK được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,
Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…
- Acetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Giống vi
khuẩn A. xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP
Hà Nội 2.
1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phosphor, các yếu tố tăng
trưởng và các yếu tố vi lượng.
Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi cấy A.
xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như trong bảng
1.1.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành Phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30%- 60%

thành các vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình thành các dải. Các dải
có chiều dày 3- 4 nm, chiều rộng 70 – 80 nm; 3,2 x133 nm. Cấu trúc của CVK phụ
thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [3], [14]. Cấu trúc hóa học được trình bày
trên hình 1.1

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
1.1.4. Một số đặc tính của màng CVK
Màng cellulose sản xuất bởi các chủng A. xylinum có độ tinh sạch cao với
nguồn gốc thực vật như hemicellulose, pectin và lignin (Kurosumiet al. 2009). Nó
thể hiện tính độc nhất và cấu trúc đặc tính sinh hóa như sợi nano siêu mịn với
cấu trúc mạng (1,5 - nm chiều rộng) [18]. CVK thể hiện độ hấp thụ nước tốt do
cấu trúc mặt lưới của nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn đảm bảo cho nó hấp thụ
nước một cách tốt nhất (khoảng 200 lần trọng lượng của nó) [21]. Sản phẩm này có
những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết
5


tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, giữ ẩm tốt, không độc và
không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn mà
không làm thay đổi cấu trúc hay tính chất [13].Với các tính chất này CVK rất phù
hợp để chọn lựa cho ứng dụng hấp thụ thuốc.
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
Cellulose được tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn và đặc biệt là A. xylinum
là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng cacbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý
của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp
với quá trình tạo glucose.
Ngày nay, quá trình tổng hợp cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bước liên
tiếp, gồm 2 giai đoạn chính: giai đoạn polyme hoặc giai đoạn kết tinh.
Phương pháp sản xuất CVK: lên men tĩnh và lên men động.
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng CVK


92

Maltose

7

D- Galactose

15

Surcrose

33

D- Xylose

11

Cellobiose

D- Arabinose

14

D- Sorbose

11

6

250C đến 300C. Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm. Nếu nhiệt độ
7


quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào
và hiệu suất lên men sẽ giảm.
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên quyết,
quyết định đến năng suất tạo màng CVK là độ thông khí. Tùy vào thời gian nuôi
cấy để người ta thu được màng với độ dày mong muốn. Thường 24 giờ sau khi
nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng
lên. Sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên.
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc
1.2.1. Trên thế giới
CVK là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc.
Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK với một
số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược
điểm của thuốc ở dạng thông thường.
Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của CVK là như một
màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng. Các nghiên cứu của một
số tác giả như Fontana và cs (1990) [26]; Czaja và cs (2006) [17], Czaja và cs
(2007) [25] đã chỉ ra CVK có khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch tiết, làm
giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỉ lệ nhiễm trùng vết thương,
giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm tra. Bên cạnh đó, với vết thương mất da, nhiễm
trùng trên da, CVK đáp ứng được nhu cầu giữ ẩm cho da, tránh da bị khô
Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của CVK, một số tác giả nghiên cứu về
lidocaine

[9],


Tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [2], [3] đã
tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylinum đạt hiệu quả cao.
Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng
dụng màng CVK điều trị bỏng da với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất tái
sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm
hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường. Tác giả Đinh Thị Kim
Nhung và cs (2012) [7], [8] đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm màng
CVK trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid 0,1% có tác dụng kháng khuẩn và
tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc kích ứng da, không gây rối loạn toàn
thân.
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh
CVK có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thụ một số loại thuốc. Đây cũng là một
hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng dụng màng CVK trong
việc hấp thụ thuốc neomycin.

9


1.3. Tổng quan về neomycin
Neomycin là loại kháng sinh nhóm aminoglycosid được phát hiện vào năm
1949 từ phòng thí nghiệm của Waksman. Neomycin được sản xuất từmôi trường
nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [1].
1.3.1. Công thức
Tên thông thường: Neomycin
Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6 –
[(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –[(2R,3R,4R,5S,6S)–
3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2 – yl] oxy – 3 – hydroxy
– 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –hydroxycyclohexyl] oxyoxane –
3,4 – diol [10].
Công thức phân tử: C23H46N6O13. Khối lượng phân tử: 614.65g/mol.

có tính đồng thời và kết quả là tế bào vi khuẩn bị chết [20].
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
Neomycin được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và
mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1]. Neomycin hầu như không hấp
thụ qua đường tiêu hóa (sinh khả dụng đạt 3 – 10% do bị gan phá hủy). Neomycin
không được dùng đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của thuốc. Neomycin
11


cũng được khuyến cáo tránh dùng tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây
mẫn cảm trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid
khác [21].
1.4. Tình hình nghiên cứu về neomycin
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1949 Selman A. Waksman phát hiện neomycin được sản xuất từ môi
trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [14]. Các nhà khoa học trên đã tìm ra
quá trình sinh tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của neomycin.
Pedersoli W. M. và cs (1994) [14] nghiên cứu về sự hấp thụ của neomycin trên bê
con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả cho thấy neomycin hấp thụ đạt tỷ lệ không
cao, đã bị đào thải qua thận lớn, việc này gây đầu độc cho thận.
Ngoài ra nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [19] cũng chỉ ra rằng
neomycin sulfate cải thiện hoạt động kháng khuẩn của neomycin đơn thuần, do
neomycin sulfate ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể hơn. Alguacil J. và cs
(2015) [13] cũng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các dạng thế hệ của
neomycin. Amita H. và cs (2015) [13] nghiên cứu và tìm ra công thức chế tạo gel
chứa neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và
cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt. Điều đó giúp tăng cường sinh khả
dạng tại chỗ cũng như hiệu quả giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt.
1.4.2. Tại Việt Nam
Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1 [5].
- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 1130C trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15 phút
rồi để nguội môi trường.
13


- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc đều tay cho giống
phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày ở
260C.
- Bước 6: Thu màng CV thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng CV
Thành phần

Khối lượng

Glucose

30g

Pepton

10g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
Màng CVK tinh chế
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng CVK
- Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường [6].
- Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH
3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng.
Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [6].
- Ngâm nước: màng sau khi ngâm bằng HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm
nước để trung hòa hết acid trong thời gian 48 giờ ta thu được CVK tinh khiết.
- CVK sau khi được tinh chế, ép loại bỏ bớt nước.
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng neomycin
- Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu
dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 277nm.
15


- Pha thuốc neomycin ở các nồng độ là: 0,05mg/ml, 0,1mg/ml, 0,15mg/ml,
0,2mg/ml, 0,25mg/ml, 0,3mg/ml
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo cường độ quang
phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 277nm trong các dung dịch mẫu
chuẩn [6].
- Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn neomycin bằng phần
mềm Excel 2013.
- Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và
đo quang phổ 3 lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
2.2.3. Chế tạo màng CVK hấp thụ neomycin
2.2.3.1. Chuẩn bị bộ đệm

Thêm đến mức 800ml
bằng nước cất.
Điều chỉnh pH tới 7,4
bằng HCl.
Bổ sung nước tới
1000ml.
Khử trùng.