TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BÙI MINH TƯƠI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ
TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG
(Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH: NÔNG HỌC

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: NÔNG HỌC

Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ
TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG
(Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)

Cán bộ hướng dẫn:


PGs. Ts. Lê Văn Hòa

1

Ths. Nguyễn Văn Ây


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG


Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành
Nông học với đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY
TRE RỒNG (Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)”. Do sinh viên Bùi
Minh Tươi thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng ngày….tháng….năm 2011.

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ....................................
Ý kiến hội đồng: ......................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2011
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CHỦ NHIỆM KHOA



:

xã Tân Thới, huyện Ô Môn, tỉnh Cần Thơ

Họ tên cha

:

Bùi Văn Vốn

Họ tên mẹ

:

Đào Thị Kim Phượng

Quê quán

:

xã Tân Thới, huyện Phong Điền, TP. Cần Thơ

Quá trình học tập

:

Năm 2007

:


5


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Mục lục ............................................................................................................vi
Danh sách chữ viết tắt và thuật ngữ ............................................................... viii
Danh sách bảng ................................................................................................ix
Danh sách hình ..................................................................................................x
Tóm lược..........................................................................................................xi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 2
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY TRE RỒNG .............................. 2
1.1.1 Nguồn gốc – phân loại .................................................................2
1.1.2 Đặc tính thực vật .........................................................................2
1.1.3 Phân bố ........................................................................................ 3
1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT .....................................3
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống ......................................................... 3
1.1.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô thực vật ....................................3
1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật .............................. 4
1.2.4 Các yếu tố khác ............................................................................ 8
1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY TRE ĐÃ ĐƯỢC
CÔNG BỐ ........................................................................................................9
1.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ IN VITRO
BẰNG MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ ..................... 11
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................... 12



CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 24
4.1 KẾT LUẬN....................................................................................... 24
4.2 ĐỀ NGHỊ .......................................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 25

8


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

PTT

Phòng tăng trưởng

SKC

Sau khi cấy

MS

Murashige và Skoog

NAA

Naphthalene acetic acid

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến số lượng chồi
nhỏ (< 2 cm) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro theo thời gian
(ngày SKC)

17

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến chiều cao (cm)
gia tăng của cụm chồi cây tre Rồng in vitro theo thời gian (ngày
SKC)

18

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến hàm lượng các
sắc tố trong lá (mg/g lá tươi) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro
vào thời điểm 50 ngày SKC

20

3.5 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ (%) ra rễ
của cụm chồi cây tre Rồng in vitro 30 ngày SKC

21

3.6

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến số rễ/cum chồi
của cụm chồi cây tre Rồng in vitro 30 ngày SKC

21


ngày SKC

17

3.2

Các sắc tố sau khi được ly trích bằng dung môi acetone
80%

19

3.3

Phổ diện sắc tố của các nghiệm thức sau khi đo bằng máy
quang phổ Perkin Elmer

19

3.4

Sự sinh trưởng của cụm chồi tre Rồng in vitro trên môi trường
tạo rễ vào thời điểm 30 ngày SKC

22

11


BÙI MINH TƯƠI. 2011. “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy
đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây tre Rồng (Dendrocalamus giganteus Wallich

Wallich ex Munro) là một trong những loại tre có thân to, thích nghi với nhiều vùng
đất và điều kiện khí hậu khác nhau. Từ những kết quả đạt được cùng với những
tiềm năng trong tương lai không xa, việc nhân giống cây tre này là rất cần thiết. Kỹ
thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã hoàn thiện về mặt quy trình và
đang được ứng dụng rộng rải, cây giống được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy mô
có một số ưu điểm như: tạo ra được số lượng giống lớn, kích thước và chất lượng
đồng đều, sạch bệnh và nhanh tuy nhiên giá thành cây con giống còn cao. Cây
giống cây tre Rồng nuôi cấy mô còn rất khan hiếm. Quy trình nhân giống in vitro
cây tre Rồng đã được Nguyễn Văn Ây (2009) xây dựng nhưng giá thành còn khá
cao. Vì vậy việc làm giảm giá thành giống tre này là việc làm cần thiết. Vì những lý
do trên, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự
nhân chồi và tạo rễ in vitro cây tre Rồng” được thực hiện nhằm hoàn thiện quy
trình sản xuất và tìm ra môi trường nuôi cấy mô thích hợp góp phần giảm giá thành
cây giống cây tre Rồng nuôi cấy mô.

13


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY TRE RỒNG

1.1.1 Nguồn gốc – phân loại
Tre Rồng có tên khoa học là Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro
thuộc nhóm cây một lá mầm, họ Hoà Thảo (Poaceae), họ phụ Tre – Trúc
(Bambusoideae). Theo Ngô Quang Đê (2003), từ “tre” theo cách gọi và cách hiểu
của người Việt Nam là để chỉ các loài có thân mọc cụm, vách thân khí sinh dày, từ
“nứa” để chỉ chung các loài có thân mọc cụm nhưng vách thân khí sinh mỏng, từ

Bình Phước,…
1.2

SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô là ngành khoa học sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các

đỉnh sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây. Sự thành công của vi nhân
giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố: môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật, giống, nhiệt độ, ánh sáng, cách chọn mẫu vật (Dương Công Kiên,
2007) và tất cả các giai đoạn nuôi cấy (Debergh và Zimmerman, 1991).
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống
Nuôi cấy mô thực vật được chia làm 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có một chức
năng riêng:
Giai đoạn 1: khử trùng mẫu cấy
Giai đoạn 2: nhân chồi nhanh
Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Giai đoạn 4: thuần dưỡng
Trong đó giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượng cây con có thể tạo ra.
Sự thành công ở giai đoạn này không những phụ thuộc vào sự kích thích chồi bất
định hay là sự phát triển chồi bên mà còn tuỳ thuộc vào số lần cấy truyền, hệ số
nhân giống và môi trường xung quanh (Debergh và Zimmerman, 1991).
Thí nghiệm được thực hiện ở giai đoạn 2 và 3.
1.2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nhân giống mang lại nhiều ưu điểm nổi bật như
tạo cây sạch bệnh, hệ số nhân giống cao và thời gian sản xuất được rút ngắn (Dương
15


Công Kiên, 2007). Vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối
với những cây sinh sản chậm hoặc là những cây cần cung cấp số lượng giống lớn


(2006) thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tuỳ thuộc vào loài thực vật, loại tế
bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các
chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: các
khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường, các vitamin và các chất điều hoà
sinh trưởng.
Ngoài ra người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định
(amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như: nước
dừa, dịch trích nấm men,… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
 Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta sử dụng
nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
 Các nguyên tố khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô
cây và không gây độc (Lê Văn Hoà và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Nhu cầu khoáng
đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các
nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium
(K), Magnesium (Mg) và Calcium (Ca) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên,
2002).
 Các nguyên tố khoáng vi lượng
Đây là những nguyên tố mà cây trồng cần rất ít nhưng không thể thiếu cho sự
sinh trưởng và phát triển bình thường của cây. Các nguyên tố vi lượng được cung
cấp là: Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (K), Đồng (Cu), Molybden (Mo),
Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp hơn 30 mg/l,
các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
 Nguồn carbohydrate
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang
hợp rất ít do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác. Vì vậy phải

(Nguyễn Xuân Linh, 1998). Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng
nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu
cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước và hoạt động của cytokinin
trong môi trường agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
18


Độ tinh khiết của agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng. Người ta
chứng minh được rằng trong agar có chứa Ca, Mg, K, Na và sự thay đổi hàm lượng
agar sẽ làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
 Nước dừa
Thành phần nước dừa khá phong phú như: myo – inositol, các chất thuộc
nhóm cytokinin (Vũ Văn Vụ et al., 2006) và một số amino acid khác (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống như
cytokinin là chất chính trong nước dừa (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Các thành phần
này có hàm lượng thay đổi khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau
giữa những quả cùng độ tuổi (Vũ Văn Vụ et al., 2006). Trong nuôi cấy mô thường
sử dụng nước dừa từ quả dừa bánh tẻ và quả dừa già.
 Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh
hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử
dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó (Vũ Văn Vụ et al., 2006).
Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành
lập chồi và tạo rễ. Tỷ lệ cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi,
ngược lại thích hợp cho việc tạo rễ, còn ở mức cân bằng thì thích hợp cho việc tạo
mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Auxin
Auxin được chia làm hai loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. Auxin tự
nhiên được tìm thấy là indole – 3 – acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là indole –

phụ thuộc vào pH môi trường. Đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibberellin và các
vitamin. Sự hấp thu các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. Để điều chỉnh pH có
thể dùng dung dịch NaOH 10% hoặc NaOH 1N và dung dịch HCl 1N (Nguyễn Đức
Thành, 2000). pH của đa số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh giữa 5,5 – 6 trước
khi hấp khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển
sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Vũ Văn Vụ et al., 2006).
1.2.4 Các yếu tố khác
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), các yếu tố sinh lý như cường độ và thời gian
chiếu sáng, nhiệt độ, nồng độ CO2, ẩm độ bình nuôi cấy, ẩm độ vườn ươm,… cũng
có ảnh hưởng đáng kể đến vi nhân giống. Nhiệt độ chung cho các phòng tăng
20


trưởng được điều chỉnh là 26 ± 2 oC. Nhiệt độ trong các keo lọ nuôi cấy thường cao
hơn nhiệt độ trong phòng vài độ do hiệu ứng nhà kính. Cần giữ ổn định nhiệt độ
trong suốt quá trình nuôi cấy.
Quang phổ ảnh hưởng đến hình thái của cây cho nên cần lưu ý đến tỷ lệ của
phổ ánh sáng xanh dương/đỏ hoặc đỏ/cuối đỏ.
Cường độ ánh sáng thích hợp là khoảng 30 µmol.m-2.s-1 dưới điều kiện này
sự nuôi cấy còn trong giai đoạn tạp dưỡng.
Nhiệt độ trong khoảng từ 17 – 25oC thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo
mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp
với một nhiệt độ khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
1.3

MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY TRE ĐÃ ĐƯỢC

CÔNG BỐ
Ở nước ta các công trình nghiên cứu trên cây tre còn hạn chế, việc nhân
giống chủ yếu bằng phương pháp truyền thống như bằng gốc, thân ngầm, hom cành,

việc bổ sung BAP 2 mg/l sẽ thích hợp cho sự nhân chồi hay bổ sung IBA 20 mg/l sẽ
thích hợp cho giai đoạn tạo rễ.
Theo Lin et al. (2007) sử dụng môi trường MS có bổ sung TDZ 0,45 µM để
nhân chồi và cho thấy môi trường lỏng có hiệu quả hơn môi trường đặc khi nhân
giống tre Bambusa oldhamii Munro; hiệu quả tạo rễ đạt 83% khi sử dụng môi
trường MS lỏng có bổ sung NAA 10,74 – 26,85 µM trong giai đoạn tạo rễ in vitro.
Mặt khác, Gillis et al. (2007) cũng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo phôi vô
tính giống Bambusa balcooa Roxburgh trên môi trường MS cải tiến.
Diab và Mohamed (2008) sử dụng đốt thân của giống tre Oxytenanthera
abyssinica A. Rich. Munro ở giai đoạn 12 tháng tuổi để tiến hành nhân giống in
vitro trên môi trường MS. Kết quả cho thấy: môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l kết
hợp với NAA 0,2 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn tạo chồi; môi trường tạo rễ
thích hợp nhất là môi trường MS có bổ sung IBA 8 mg/l.
Mudoi và Borthakur (2009) đã sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 1 mg/l
cho thấy hiệu quả nhân chồi gấp 10 lần sau 4 tuần nuôi cấy từ cụm chồi chứa 2 – 3
chồi con trên giống tre Bambusa balcooa Roxb., tỷ lệ tạo rễ lên đến 75% khi sử
dụng môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l kết hợp với NAA 3 mg/l trong giai
đoạn tạo rễ và tỷ lệ sống sau thuần dưỡng đạt trên 90%.

22


1.4

MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ IN VITRO BẰNG

MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
Theo kết quả nghiên cứu trên cây Khóm và cỏ Vetiver (Lê Văn Bé et al.,
2003) và cây phong lan (Vũ Ngọc Phượng et al.,2007) thì hai điều kiện nuôi cấy
(trong và ngoài phòng tăng trưởng) cho kết quả nhân chồi không khác biệt có ý