BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*****

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG

DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung ......................................... 3
1.2. Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung .................. 5
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung ........ 14
1.4. Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn ............. 21
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung........... 22
1.6. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu........................................................... 24
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 27
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 27
2.2. Trang thiết bị .............................................................................................. 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40
3.1. Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 40
3.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ....................................................................... 46
3.3. Thiết lập chất đối chiếu ............................................................................... 69
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng
alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC ............................................................. 82
3.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá
Trinh nữ hoàng cung.......................................................................................... 99


ii

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 102
4.1. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung ........... 102
4.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ...................................................................... 107

AR-96

Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

As

Hệ số bất đối

CĐC

Chất đối chiếu

CE

Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản)

Corr Area

Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)

CZE

Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

d

doublet (đỉnh đôi)

DĐVN IV


FL-SFE

Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE

FR-96

Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96%

GC

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS

Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

GLP

Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC


NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân)

PĐ

Phân đoạn

PDA

Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PCRS

Primary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

PTN

Phòng thí nghiệm

RSD

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

Rs

độ phân giải giữa pic có thời gian lưu nhỏ và lớn hơn kề bên

S

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

TR

Thời gian lưu (phút)

TM

Thời gian di chuyển (phút)

TNHC

Trinh nữ hoàng cung

TGA

Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng)

TT

Thuốc thử

UV-Vis

Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC

Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)



vi

Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE................... 95
Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC. ........................................... 97
Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.......................................... 98
Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic. ............. 113
Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient. .............. 113
Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC. . 114
Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol. ................................ 115
Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM. . 115
Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4.............. 115
Hình 4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha
động methanol và acetonitril . .............................................................................. 116

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC........................... 29
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE
và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%........................................................ 32
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC .............. 42
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC. ...................................... 42
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết. 45
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE. .................. 50
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA. .............................. 82


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC. .............. 81
Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.................. 83
Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 83
Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 86
Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). .................................... 87
Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). . 88
Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6)............................... 90
Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). ........................ 90
Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ......................................... 91
Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6). ............................... 93
Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ......................................... 93
Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). ........................... 94
Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6). .................................. 96
Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9). ............................. 96


1



có công trình công bố việc định lượng đồng thời một số alcaloid hay flavonoid trong
lá TNHC.
Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận cây TNHC. Do đó, vấn đề quản lý và
đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có thành phần TNHC vẫn chưa
được thực hiện một cách chặt chẽ.
Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của dược liệu vẫn chưa được nghiên
cứu toàn diện; chất đánh dấu trong nguyên liệu chưa được xác định và hoàn toàn chưa
có bất kỳ chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường.
Với mong muốn góp phần giải quyết các bất cập hiện tại và góp phần vào công tác
“Đảm bảo chất lượng” cho dược liệu Trinh nữ hoàng cung, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu
và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid
cho cây Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”
với 4 mục tiêu chính như sau:
1. Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid và phân lập các
hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung.
2. Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh nữ hoàng cung.
3. Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh nữ
hoàng cung bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản.
4. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược
liệu Trinh nữ hoàng cung.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
1.1.1. Họ Amaryllidaceae và chi Crinum
Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu của các nhà thực vật học Việt nam