BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE
THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ

Ngành học :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện :

NGUYỄN CÔNG PHÁT

Niên khóa :

2008 – 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE

dỗ con khôn lớn, luôn động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt thời
gian học tập ở Trƣờng đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Công Phát

i


TÓM TẮT
Ngày nay vấn đề an ninh lƣơng thực đang là một thách thức đối với ngành nông
nghiệp của các nƣớc trên thế giới. Trong khi đó, đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp,
môi trƣờng bị ô nhiễm, thiên tai, biến đổi khí hậu cho nên yêu cầu bức thiết đƣợc đặt ra là
phải tạo ra các sản phẩm phân bón phục vụ cho trồng trọt nhằm cải thiện năng suất cây
trồng và đặc biệt là phải thân thiện với môi trƣờng. Dựa trên cơ sở đó đề tài “nghiên cứu
ứng dụng enzyme protease thủy phân nhau heo tạo phân bón lá” đã đƣợc thực hiện.
Nội dung bao gồm phân lập vi khuẩn từ các mẫu bùn đáy ao, ruột cá, đất, sau đó sử
dụng các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát khả năng
sinh enzyme protease của vi khuẩn phân lập và các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của
enzyme protease do vi khuẩn sản sinh. Khảo sát các điều kiện tối ƣu nhằm xây dựng quy
trình thủy phân nhau heo để tạo phân bón lá hữu cơ sinh học. Ứng dụng thử nghiệm phân
bón lá trên rau cải bẹ xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm
phân bón lá tự tạo.
Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 5 chủng Bacillus subtilis, trong đó có 2
chủng từ mẫu đất và 3 chủng từ ruột cá. Chủng Ba17 phân lập từ đất có khả năng phân
giải casein tốt nhất và tổng hợp enzyme protease với hoạt độ cao nhất ở điều kiện tối ƣu
500C và pH 7,6 là 31,95 UI/g.
Quy trình tối ƣu cho quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease đƣợc
thiết lập với điều kiện pH 7,6, nồng độ enzyme so với cơ chất là 2 UI/g, lƣợng nƣớc so
với cơ chất là 150%, nhiệt độ thủy phân là 500C và thời gian là 48 giờ.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................. i
Tóm tắt ..................................................................................................................................ii
Summary............................................................................................................................. iii
Mục lục ................................................................................................................................ iv
Danh sách các từ viết tắt .....................................................................................................vii
Danh sách các bảng .......................................................................................................... viii
Danh sách các sơ đồ và hình ............................................................................................... ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2
1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 3
2.1.1

Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................... 3

2.1.2

Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 3

2.1.3

Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................................... 4



2.2.6

Ứng dụng của enzyme protease............................................................................... 8

2.3 Sơ lƣợc về phân bón lá hữu cơ sinh học .................................................................... 10
2.3.1

Xu hƣớng nghiên cứu phân hữu cơ sinh học trong và ngoài nƣớc ....................... 10

2.3.1.1

Các nghiên cứu trong nƣớc ................................................................................. 10

2.3.1.2

Các nghiên cứu ngoài nƣớc ................................................................................. 11

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 13
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 13
3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu .................................. 13
3.3 Nôi dung và phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 13
3.3.1

Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 13

3.3.1.1

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá .......................... 13


4.1.3

Đặc điểm sinh hóa của 14 chủng trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng ..................... 19

4.1.4

Hoạt độ enzyme protease của các chủng đƣợc chọn ............................................. 21

v


4.2 Các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease ......................................... 21
4.2.1

Nhiệt độ tối ƣu cho enzyme hoạt động.................................................................. 21

4.2.2

Xác định pH tối ƣu cho enzyme hoạt động của enzyme protease......................... 22

4.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease ..... 23
4.3.1

Ảnh hƣởng nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân .......................................... 23

4.3.2

Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân ........................................... 24

4.3.3

IUBMB

International Union of Biochemistry and Molecular Biology

LLL

Lần lặp lại

NA

Nutrient agar

NB

Nutrient Broth

NT

Nghiệm thức

NSLT

Năng suất lý thuyết

NSTT

Năng suất thực tế

NTS



DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Trang
Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................... 17
Sơ đồ 3.2 Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................... 18
Sơ đồ 3.4 Bố trí thí nghiệm dùng các nồng độ khác nhau của chế phẩm phân bón lá ..... 22
Sơ đồ 4.1 Qui trình thủy phân nhau heo trên hệ thống bioreactor .................................... 30
Hình 2.1 Vi Khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................... 3
Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ................................................................. 18
Hình 4. 2: Tiêu bản nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi cấy 24 giờ ............. 19
Hình 4.3 Vòng phân giải casein của chủng Ba17 ............................................................. 20
Hình 4.3 Phần dịch sau thủy phân .................................................................................... 27
Hình 4.4 Phần bã sau thủy phân ....................................................................................... 29
Hình 4.5 Cây cải đƣợc phun ở các nồng độ phân khác nhau............................................ 29

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, dân số thế giới đã 7 tỉ ngƣời cùng với tốc độ tăng dân số đáng báo động
và vấn đề môi trƣờng đang ngày càng bị suy thoái, thiên tai, lũ lụt, biến đổi khí hậu đặc
biệt là đất nông nghiệp đang bị thu hẹp một cách nhanh chóng làm cho sản lƣợng lƣơng
thực có nguy cơ bị sụt giảm nghiêm trọng do đó vấn đề an ninh lƣơng thực đang trở nên
cấp thiết hơn bao giờ hết. Trong ngành trồng trọt, để phát triển một nền nông nghiệp bền
vững thì nhiệm vụ cấp bách là phải thay thế dần việc sử dụng phân bón hóa học có nguồn
gốc vô cơ gây ô nhiễm môi trƣờng, làm giảm độ phì nhiêu của đất sang các loại phân bón
vi sinh, hữu cơ vi sinh, compost, phân bón lá. Trong lĩnh vực vi sinh, vi khuẩn Bacillus
subtilis có nhiều tính chất rất ƣu việt để sản xuất các chế phẩm sinh học và đặc biệt là
chúng có khả năng sinh enzyme protease với hoạt độ rất cao. Enzyme protease của vi

xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm phân bón lá tự tạo.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dƣơng đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho
đến thời điểm hiện nay. Bộ gen của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, khoảng 4 Mbp với
trọng lƣợng của bộ gen khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton. Đặc biệt, trong gen của
Bacillus subtilis có chứa nhiều gen qui định cho khả năng kháng kháng sinh nhƣ gen
kháng

thiostrepton,

streptomycin,

erythromycin,

spectinomycin,

penicilin,

chloramphenicol. Nhờ đó vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng kháng lại các vi sinh vật
gây bệnh khác.
2.1.1 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Giới:

Bacteria

bào tử ở trung tâm có kích thƣớc 1,5-1,8 x 0,8µm. Ở điều kiện 1000C, bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis chịu đƣợc 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn,
tác động của hóa chất, tia bức xạ (Kerovuo và cs, 2000).

3


2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy
Trong môi trường nuôi cấy, Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết
các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm). Màng sinh học giúp cho Bacillus
subtilis có ưu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trường tự nhiên
đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trường giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc
trực tiếp với oxy trong không khí. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng
hình thành bào tử. Bào tử của chúng tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn
năm và phát triển lại thành tế bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
2.1.4 Đặc điểm sinh hoá
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), phân giải tinh bột (+), phân
giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên
men không sinh hơi các loại đƣờng như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose.
2.1.5 Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis
Vi khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau
như amylase, protease đồng thời cũng được ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men
truyền thống natto của Nhật Bản.
Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang được quan tâm để sản xuất ra các
vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gen qui định độc tố thương hàn vào
Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gen này cũng được biểu hiện để sản
xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử.
2.2 Sơ lƣợc về enzyme protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thủy phân các liên kết peptid của
protein hay polypeptide (-CO - NH-) tạo thành các sản phẩm peptide, pepton, tri –

động vật (Willstatter và cs 1926). Từ 1930 đến nay, sau khi Sumner (1926) kết tinh đƣợc
protease từ đậu tƣơng, hàng loạt các protease khác ra đời. Năm 1950, nhờ sử dụng đƣợc
một số phƣơng pháp mới tinh chế protein, ngƣời ta thu nhận đƣợc chế phẩm protease tinh
khiết hơn và cũng từ đấy các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease từ vi sinh. Năm
1971 đánh dấu bƣớc mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở
Bacillus. Horikoshi là ngƣời đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ
bản và tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus (Horikoshi, 1971; Markland và cs,
1971). Sang năm 1972, ngƣời ta đã nghiên cứu và đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn các
protease kiềm ở một vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease
kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trƣờng
thƣơng mại. Các vi khuẩn Bacillus ƣa kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo
“quan điểm công nghiệp (Horikoshi và Akiba, 1982; Horikoshi, 1996). Đến nay protease
đã đƣợc nghiên cứu kỹ hơn và ứng dụng rất nhiều lĩnh vực khác nhau.
2.2.2 Phân loại protease
Dựa vào cơ chế xúc tác. Theo IUBMB “International Union of Biochemistry and
Molecular Biology” peptidase chia thành hai nhóm: Exopeptidase (còn gọi là enzyme
peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch) có khả năng thủy giải liên kết –CO – NH ở đầu
tận cùng chuỗi polypeptide, bao gồm amino – peptidase (xúc tác đầu có gốc amin tự do
gọi là enzyme aminopeptidase), carboxyl – peptidase (xúc tác cắt liên kết – CO – NH ở
đầu có gốc carboxyl tự do gọi là enzyme carboxypeptidase). Endopeptidase (còn gọi

5


proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch) có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên
kết peptide nằm bên trong chuỗi polupeptidase.
Dựa vào mức hoạt động trong dung dich có trị số pH khác nhau nên protease đƣợc
chia làm ba nhóm: Protease aicid với pHopt trong khoảng 2 – 5 và chúng đƣợc thu nhận từ
các loài nấm mốc đen: A. niger, A. awmori, A. saitoi, và các loài Mucor pusillus,
Rhizopus, Trametes sanguineara. Protease trung tính có pHopt khoảng hẹp 6,0 – 7,5 không

thermopoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium; có thể nói vi khuẩn Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các
vi khuẩn thƣờng tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm
yếu, các protease này có ái lực cao với các amino axit ƣu béo và thơm. Protease của
Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân tử 20.000 – 30.000 dalton.
Ổn định ở khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. Khác với
protease thƣc vật (ficin, papain, bromeline) và động vật (tripsin, pepsin, renin) protease vi
sinh vật là những enzyme ngoại bào có tính đặc hiệu rộng, chúng tổng hợp hai dạng
enzyme có khả năng thủy phân khác nhau nhƣ: protease thủy phân protein thành
polypeptide, pepton và peptidase thủy phân tiếp các hợp chất này thành các axit amin.
2.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme protease
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất: Trong các phản ứng enzym, sự hoạt hóa cơ chất
đƣợc thực hiện do sự tạo thành phức hợp trung gian enzym - cơ chất. Khi kết hợp với
phân tử enzym do sự chuyển dịch các điện tử và sự biến dạng của các liên kết tham gia
trực tiếp vào phản ứng nên cơ chất trở nên hoạt động và tham gia phản ứng dễ dàng. Cơ
chất càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Nhƣ thế, khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản
ứng sẽ tăng theo và đạt giá trị cƣc đại sau đó sẽ ổn đinh mặc dù nồng độ cơ chất vẫn tăng.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Vận tốc phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, tuy
nhiên do enzym có bản chất là protein nên không thể bền với tác dụng nhiệt, đa số enzym
bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiệt độ ứng với khả năng hoạt động cao nhất của
enzym đƣợc gọi là nhiệt tối ƣu và phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ nồng độ enzym, nồng
độ cơ chất, đặc biệt là thời gian tác dụng. Thời gian tác dụng càng dài, nhiệt tối ƣu của
enzym càng thấp. Nói chung, enzym ở dạng dung dịch loãng, không có cơ chất thƣờng
kém bền. Trái lại khi có cơ chất, enzym khá bền với nhiệt độ.
Ảnh hƣởng của pH: Enzym rất nhạy đối với sự thay đổi pH của môi trƣờng. Mỗi
enzym chỉ hoạt động mạnh ở một vùng pH xác định gọi là vùng pH tối ƣu của enzym. pH
tối ƣu của đa số enzym nằm trong vùng axit yếu, bazơ yếu hoặc trung tính. Hoạt động của
enzym còn chịu ảnh hƣởng của chất hoạt hóa và chất ức chế.

7

tạo thành có hàm lƣợng axit amin rất cao. Phƣơng pháp lên men có những ƣu điểm nhƣ

8


thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, vốn đầu tƣ ban đầu không lớn, không gây độc cho ngƣời sản
xuất và môi trƣờng xung quanh. Ứng dụng protease trong chế biến thịt: Trong chế biến
thịt, ngƣời ta bổ sung 0,002% chế phẩm protease tinh khiết và đem ƣớp lạnh, bằng cách
này thịt sẽ giữ màu tự nhiên lâu hơn. Mặt khác, thịt dƣợc xử lý bằng protease có hiệu suất
hấp thụ cao hơn với thịt không xử lý. Ứng dụng trong chế biến sữa: Trong chế biến sữa
(đặc biệt là trong sản xuất phomat) ngƣời ta sử dụng một khối lƣợng rất lớn enzyme đông
tụ sữa. Trƣớc dây, ở các nƣớc châu Âu thƣờng sử dụng các loại protease động vật, đến
nay ngƣời ta sử dụng các loại protease từ nhiều nguồn khác nhau. Chính sự thay thế các
loại enzyme từ vi sinh vật đã làm giảm giá thành sản phẩm chế biển từ sữa (Nguyễn Đức
Lƣợng, 2002).
Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc: Protease phân cắt liên kết peptid
của phân tử protein, giúp tăng khả năng hấp thu lƣợng protein có trong thức ăn. Việc
kết hợp giữa protease với các enzyme khác nhƣ: amylase, phytase, cellulose giúp vật
nuôi tăng trọng nhanh đạt hiệu quả kinh tế cao.
Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa: Từ năm 1913, enzyme đã đƣợc ứng dụng
trong sản xuất chất tẩy rửa tại nhà máy hóa chất Otto Rohm (Đức). Chế phẩm Bio 40 là
enzyme protease từ vi khuẩn và đƣợc ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa từ năm 1959
tại nhà máy Gebruder Schuyder ở Thụy Điển (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong công
nghiệp da: Việc sản xuất da động vật hiện nay hoàn toàn là thủ công. Enzyme protease
có thể đƣợc ứng dụng vào một vài công đoạn của công nghiệp da bằng cách ngâm da
chìm trong dịch chứa enzyme ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10-20 giờ nhằm tách
lông thú ra khỏi da và làm sạch da.
Sản xuất insulin cho ngƣời từ insulin heo: Insulin của ngƣời và heo chỉ khác
nhau một axit amin (threonin hay alanin). Trong công nghiệp sản xuất insulin cho
ngƣời từ insulin từ heo ngƣời ta sử đụng hai loại enzyme là carboxypeptidase A và

dụng các loại phân bón lá để thử nghiệm trên cây bắp, rau xà lách, hành, cây hoa cúc và
hoa vạn thọ của đã cho năng suất cao hơn nghiệm thức đối chứng (NTĐC) từ 5% đến
20,9% (Nguyễn Thị Kim Thanh, 2008). Bên cạnh đó, việc phối trộn các phế thải nông
nghiệp với các chế phẩm sinh học để sản xuất phân bón gốc cũng mang lại những lợi ích
to lớn trong sản xuất nông nghiêp nhƣ hàm lƣợng dinh dƣỡng đƣợc tăng cao, giảm thiểu
sự ô nhiễm môi trƣờng, sản phẩm tạo ra không có mùi hôi và giúp cây hấp thụ tốt. Theo
kết quả nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học E.I.P để ủ phân chuồng và khảo sát ảnh

10


hƣởng của phân bón lá đƣợc điều chế trên cơ sở phân ủ lên sinh trƣởng phát triển và năng
suất của cải bẹ xanh (Brassica juncea L). Kết quả nghiên cứu đề tài cho thấy sử dụng
phân bò tƣơi + tro trấu + 1/20 liều lƣợng chế phẩm EIP cho phân hoai nhanh hơn 25 ngày
và cho trọng lƣợng cải cao hơn (Nguyễn Lê Thanh, 2005).
Sử dụng các phế thải từ nông nghiệp nhƣ xác vỏ tiêu, bánh dầu đậu phộng, bánh
dầu đậu nành, xác cá chết, bột thịt để sản xuất phân bón lá đã mang lại những thành tựu to
lớn. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Đức (2006) cho thấy việc sử dụng chế phẩm
ENT ủ bã vỏ tiêu với nồng độ 0,1% đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 25 ngày, vỏ tiêu
không còn mùi hôi.
2.3.1.2 Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Các báo cáo của công ty Enviromental Choise cho thấy ở Costa Rica đã có nhiều
thí nghiệm về ủ phân nhƣ: “Ủ phân trùng và Encoenzyme”, “Ủ vỏ quả cà phê và
zymplex” , “Ủ phân gà dùng chất độn mạc cƣa và Encoenxzyme”. Kết quả cho thấy thời
gian ủ phân đƣợc rút ngắn, hàm lƣợng dinh dƣỡng bảo toàn và mùi giảm một cách đáng
kể. Cũng theo nguồn này, ở Zambia, Tây phi cũng có thí nghiệm về ủ phân nhƣ “Ủ phân
bò khô với Enchoice dùng chất độn vỏ đậu phộng nghiền nhỏ”.
Theo mô hình nghiên cứu phƣơng pháp sản xuất phân bón hữu cơ bằng cách sử
dụng đầu cá ngừ làm nguyên liệu thô. Nghiên cứu này đã sử dụng enzyme từ vi khuẩn và
thử nghiệm bổ sung phân hữu cơ này trong môi trƣờng nuôi hạt phấn cây trà. Kết quả thí



Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1/2012 đến thàng 6/2012 tại trại thực nghiệm Công
nghệ Sinh học và Môi trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh; Viện Công
nghệ Sinh học và Môi trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tự phân lập và enzyme protease tự thu nhận, nhau
heo đƣợc lấy ở một trại heo Đồng Nai, chế phẩm phân bón lá.
Các hóa chất sử dụng: Hóa chất dùng để pha thuốc thử và môi trƣờng phản ứng
sinh hóa (Trung Quốc): D- glucose, peptone, agar, NaCl, CaCO3, DAP, NaOH, K2SO4,
KH2PO4, CuSO4, NaCO3, TCA, casein, albumin, tyrosine, trisodim citrate, thuốc thử
Folin, Lugol, Safranine, napthol, methylred, phenolphthalein. Hóa chất dùng để xác định
đạm tổng số (Đức): H2SO4 đâm đặc, CuSO4, K2SO4, parafin, NaOH, H3BO3, HCl.
Các thiết bị nhƣ: tủ sấy, nồi hấp áp suất (autoclave), tủ lạnh, cân tiểu li và cân phân
tích, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, hệ thống máy Kjeldahl, máy đo OD, lò vi sóng, kính hiển
vi, tủ cấy, … cùng với tất cả các dụng cụ cơ bản đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm.
3.3 Nôi dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis
3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá
Mẫu bùn sau khi lấy về dùng muỗng gạn bỏ phần nƣớc, trộn đều rồi cân 10 g mẫu
cho vào 90 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và lắc đều, tƣơng tự mẫu ruột cá rửa nƣớc sơ
qua rồi sau đó cân 10 g mẫu và dùng kéo cắt nhỏ ra rồi cho vào 90 ml nƣớc muối sinh lý,
mẫu đất cân 10 g cho vào 90 ml nƣớc rồi đun sôi đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. Chuẩn bị
4 ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng
micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu cần phân lập có nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm 1 và trộn đều bằng micropipete, đƣợc nồng độ pha loãng 10-2, tiếp
tục làm nhƣ vậy cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng
độ pha loãng 10-3,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên


14