BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP
NẤM Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA - ITS
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN XUÂN ĐÔNG
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM

Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA – ITS
VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR

Hƣớng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:


Tháng 7 năm 2012
NGUYỄN XUÂN ĐÔNG

i


TÓM TẮT
Nấm B. theobromae gây ra bệnh nứt vỏ trên cây cao su hay còn gọi là bệnh
Botryodiplodia. Bệnh này gây hại trên thân cây cao su giai đoạn vƣờn ƣơng, vƣờn kiến
thiết cơ bản lẫn vƣờn cây khai thác. Bệnh bùng phát mạnh trong những năm gần đây
và gây thiệt hại đáng kể trên nhiều diện tích cao su trong ngành. Kiểm soát bệnh bằng
thuốc hóa học gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Kiểm soát bệnh bằng biện pháp di
truyền đang đƣợc hi vọng sẽ đem lại kết quả tốt hơn.
Trong nghiên cứu này, 20 MPL nấm B. theobromae từ các dòng vô tính khác
nhau đƣợc thu thập từ vùng khác nhau đã đƣợc tách đơn bào tử, nhân sinh khối và ly
trích DNA tổng số. Đa dạng di truyền của nấm B. theobromae đƣợc đánh giá bằng
cách khuếch đại vùng rDNA – ITS với cặp mồi ITS1 và ITS4, giải trình tự, so sánh kết
quả để tìm sự khác biệt và bằng chỉ thị ISSR sử dụng 16 mồi đa hình đƣợc sàng lọc từ
bộ sƣu tập gồm 34 mồi ISSR. Ma trận hệ số tƣơng đồng và cây phân loài đƣợc thiết
lập để đánh giá đa dạng di truyền của 20 MPL này.
Kết quả khuếch đại vùng rDNA – ITS cho thấy 20 MPL cho sản phẩm khuếch
đại có kích thƣớc nhƣ nhau, kết quả giải trình tự vùng rDNA – ITS khẳng định chúng
có cùng kích thƣớc là 541 bp và trình tự nucleotide của các MPL giống nhau hoàn
toàn. Tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng với 20 MPL đƣợc dùng trong nghiên cứu này
bằng chƣơng trình BLAST cho thấy trình tự rDNA – ITS của các mẫu nghiên cứu có
mức tƣơng đồng từ 98 – 99% so với trình tự của nấm B. theobromae có sẵn trên
GenBank. Điều này khẳng định các MPL đƣợc nghiên cứu là loài nấm B. theobromae.
Sự giống nhau hoàn toàn trong trình tự nucleotide của vùng rDNA – ITS của 20 MPL
cho thấy tính bảo tồn rất cao của vùng rDNA – ITS trong hệ gen của các MPL đƣợc

studied isolates was 98 – 99% similarity to that of rDNA – ITS of B. theobromae credited
in GeneBank. These results confirm that the studied isolates are belonged to B. theobromae
species. The identical sequences in rDNA-ITS region implied high conservation of this
region in the genome of the studied isolates.
ISSR analysis using 16 primers produced a total of 214 DNA bands, of which the
polymorphic DNA bands was accounted for 76.6%. The phylogenetic tree produced from
UPGMA analysis based on DICE coefficient divided 20 isolates into two main genetic
clusters. Analysis of these genetic clusters showed the relationship between genetic groups
and geographical origins at low levels and no relationship between genetic groups and the
host origins (rubber clones) from which B. theobromae was isolated.
Keywords : B. theobromae, rDNA-ITS, ISSR markers, genetic diversity
iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................viii
CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2.Yêu cầu đề tài ........................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................ 2
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
2.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis .............................................................. 3
2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam ..................................................................... 3
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su ..................................................................................... 3
2.2. Sơ lƣợc về nấm B. theobromae ............................................................................. 4

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 30
4.1. Kết quả ............................................................................................................... 30
4.1.1. So sánh quy trình ly trích DNA từ các MPL nấm B. theobromae ..................... 30
4.1.2. Nhận diện và phân tích đa dạng di truyền của các MPL
nấm B. theobromae dựa trên phƣơng pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS ................ 31
4.1.3. Kết quả sàng lọc mồi ISSR............................................................................... 33
4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu phân lập nấm B. theobromae
dựa trên chỉ thị ISSR ................................................................................................. 35
4.2. Thảo luận ............................................................................................................ 38
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 41
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 41
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 42
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

CTAB

: Hexacetyltrimethyl ammonium bromide


: Mẫu phân lập

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PDA

: Potato Dextrose Agar

RAPD

: Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA

: Ribosomal deoxyribonucleotide acid

RFLPs

: Restriction Fragment Length Polymorphisms

RNA

: Ribonucleic acid


: Tris acetate EDTA

TE

: Tris – EDTA

UBC

: University of British Columbia

UPGMA

: Unweighted Paired Group Method with Arithmetic Mean
vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Danh sách các mẫu nấm phân lập từ các vùng địa lý khác nhau .................. 23
Bảng 3.2 Danh sách các mồi, trình tự và nhiệt độ bắt cặp .......................................... 25
Bảng 4.1 Tổng số băng khuếch đại và tỉ lệ đa hình của các mồi ISSR
đã đƣợc sàng lọc trên 4 MPL nấm B. theobromae ...................................................... 34
Bảng 4.2 Tổng số băng DNA đƣợc khuếch đại và tỉ lệ băng đa hình
của 16 mồi ISSR dùng trong phân tích đa dạng di truyền cho 20 MPL
nấm B. theobromae .................................................................................................... 35

vii



1.1.Đặt vấn đề
Những năm gần đây, bệnh nứt vỏ hay còn gọi là bệnh Botryodiplodia, do nấm
Botryodiplodia theobromae Pat gây ra xuất hiện phổ biến và gây hại đáng kể trên cây
cao su vùng Đông Nam Bộ. Năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vƣờn cây cao su tại
Công ty Cao su Dầu Tiếng, gây hại trên vƣờn kiến thiết cơ bản và vƣờn khai thác.
Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả các giai đoạn của cây cao su từ vƣờn ƣơng, vƣờn
nhân, vƣờn kiến thiết cơ bản đến vƣờn khai thác của các dòng vô tính RRIV 4, PB
260, VM 515, PB 235, trong đó dòng RRIV 4 rất mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 2011).
Bệnh gây hại nặng vào mùa mƣa, ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, sản lƣợng và thậm chí
gây chết cây.
Đối với bệnh hại nói chung và bệnh trên cây cao su nói riêng, tuỳ từng điều
kiện cụ thể mà chúng ta có nhiều cách để kiểm soát bệnh cho phù hợp nhƣ: kiểm soát
về mặt di truyền, hoá học, sinh học… hoặc kết hợp chúng để cho ra quy trình kiểm
soát dịch bệnh hiệu quả nhất. Đối với việc phòng trừ bệnh Botrodiplodia, biện pháp
đang đƣợc ứng dụng phổ biến là sử dụng các loại thuốc hóa học. Tuy nhiên, hiệu quả
điều trị còn nhiều hạn chế do nhận diện không đúng triệu chứng bệnh, phun chƣa đúng
loại thuốc và kỹ thuật xử lý chƣa hoàn thiện (Phan Thành Dũng, 2011). Hơn nữa, việc
phun thuốc hóa học đòi hỏi nhiều nhân công lao động và hóa chất sử dụng có ảnh
hƣởng đến sức khỏe ngƣời lao động và môi trƣờng. Những năm gần đây, kiểm soát
bệnh hại bằng biện pháp di truyền học và sinh học đang đƣợc nghiên cứu ứng dụng ở
một số nƣớc trồng cao su nhằm khắc phục những hạn chế của biện pháp hoá học. Một
trong những biện pháp hữu hiệu đang đƣợc áp dụng hiện nay là trồng những dòng vô
tính cao su kháng bệnh. Tuy nhiên, đối với một số bệnh hại, mức độ bảo hộ tính kháng
bệnh ngày càng giảm với mỗi dòng vô tính và ở những vùng địa lý khác nhau thì mức
độ mẫn cảm đối với bệnh cũng khác do trong những năm qua, việc chọn lọc và cải tạo
giống cao su tập trung vào các yếu tố kinh tế nhƣ sản lƣợng cao, sinh trƣởng khỏe đã
làm thất thoát nhiều gen kháng bệnh. Điều này cũng cho thấy có sự tồn tại nhiều nòi
sinh lý khác nhau của nấm bệnh (Ismail và Jeyanayagi, 1999). Do đó, kiểm soát bệnh
bằng biện pháp di truyền (genetic control) đang đƣợc mong đợi sẽ đem lại hiệu quả
tích cực hơn.

trong ngân hàng gen (GenBank) bằng phần mềm BLAST.
 Dùng kỹ thuật PCR với chỉ thị phân tử ISSR khuếch đại DNA của các MPL. So
sánh sự khác biệt của các băng đƣợc khuếch đại trên gel điện di để phân tích đa
dạng di truyền.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis
2.1.1. Nguồn gốc cây cao su ở Việt Nam
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc Nam Mỹ, mọc hoang
dại trên một vùng địa bàn rộng lớn từ 5-6 triệu km2, bao gồm toàn bộ lƣu vực sông
Amazon và các vùng kế cận. Cây cao su xuất hiện ở Việt Nam năm 1877 sau khi thực
dân Pháp xâm chiếm nƣớc ta. Một ngƣời Pháp có tên là Pierre mang hạt giống từ
Singapore đến, lập vƣờn ƣơng thử ở Bách Thảo Sài Gòn, nhƣng không cây nào sống.
Đến năm 1897, Raul, một dƣợc sĩ hải quân ngƣời Pháp gởi hạt giống ở Java
(Indonesia) về đem gieo trồng ở trạm thí nghiệm Ông Yệm (Bến Cát - Sông Bé). Một
số hạt giống đƣợc gởi cho bác sĩ Yersin cùng với một số hạt giống xin thêm ở Co (Sri
Lanka) đƣa gieo trồng ở trại thí nghiệm của viện Pasteur (Suối Dầu, Nha Trang), tạo
thành đồn điền cao su 400 cây đầu tiên ở Việt Nam. Đến thế kỷ XX, các vƣờn cao su
đƣợc trồng tại vùng Đông Nam Bộ, sau đến thập kỷ 50, cây cao su đƣợc trồng một số
vùng ở Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000).
Tính đến năm 2008 Việt Nam có đến hơn 580.000 ha cao su (Tổng cục Thống
kê, 2008), trong đó quốc doanh quản lý hơn 250.000 ha, số còn lại do các thành phần
kinh tế khác quản lý. Hiện nay Việt Nam đã thành lập Hiệp hội cao su và là thành viên
của Hiệp hội các nƣớc sản xuất cao su thiên nhiên (ANRPC).
2.1.2. Bệnh hại trên cây cao su
Trong những thập niên qua sản lƣợng cao su không ngừng đƣợc cải thiện qua
những tiến bộ trong công tác cải tiến giống và kỹ thuật nông nghiệp. Tuy nhiên, thiệt


Ngành (Phylum) Ascomycota
Lớp (class)

Dothideomycetes

Bộ (Order)

Botryophaeriales

Họ (Family)

Botryophaeriaceae

Giống (Genus)

Botryodiplodia

Loài (species)

Botryodiplodia theobromae Pat.

2.2.2. Lịch sử phát hiện nấm B. theobromae
Nấm Botryodiplodia theobromae Patouillard [Lasiodiplodia theobromae
(Patouillard) Griffon và Maublanc] phân bố rộng ở khu vực khí hậu nhiệt đới và đƣợc
ghi nhận là loại nấm ký sinh có khả năng gây bệnh trên nhiều cây ký chủ. Nấm đƣợc
mô tả đầu tiên bởi Patouillard vào năm 1892 (Griffiths, 1966). Đến năm 1895, đã có
báo cáo đầu tiên ghi nhận loài nấm này là tác nhân gây bệnh chết ngƣợc trên cây cacao
ở Cameroon (Mbenoun và ctv, 2008). Từ đó, nấm xuất hiện và phát triển nhanh chóng
qua nhiều quốc gia, gây hiện tƣợng chết ngƣợc trên xoài (Muhammad và ctv, 2006),


Lasiodiplodia nigra Appel & Laubert, 1906; Diplodia rapax Massee, 1910; Diplodia
natalensis Pole Evans, 1911; Lasiodiplodia triflorae Higgins, 1916; Diplodia
ananassae

Sacc.,

1917;

Botryodiplodia

ananassae

(Sacc.)

Petrak,

1929.

(Punithalingam, 1976).
2.2.3. Phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh
Nấm B. theobromae phân bố khắp nơi trên thế giới, nhƣng chủ yếu giới hạn ở
khu vực vĩ tuyến 40o Bắc đến 40o Nam, có khả năng ký sinh trên 500 loại cây trồng
khác nhau (Punithalingam, 1976).
Nấm đã đƣợc ghi nhận tại nhiều quốc gia trên thế giới thuộc khu vực khí hậu
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo Goss Roger và ctv (1961), một số ký chủ của nấm là
cây trồng quan trọng đƣợc nhiều tác giả ghi nhận và nghiên cứu nhƣ cam quýt
(Nowell, 1923; Pole-Evans, 1910), cao su (Cook, 1913; Petch, 1921), chè (Cook,
1913; Johnston, 1960), cacao (Charles, 1906; Cook, 1913; Griffon và Maublanc, 1909;
Petch, 1921; Urquhart, 1961), mía đƣờng (Howard, 1901; Nowell, 1923), bông vải

năng gây thiệt hại nặng về kinh tế trên cây chuối, làm giảm sút việc thu hoạch. Từ đó,
đã có nhiều báo cáo ghi nhận nấm B. theobromae là nguyên nhân gây thối rễ và thân
chuối, nhƣng cho đến nay vẫn chƣa có nghiên cứu chi tiết nào đƣợc tiến hành và bệnh
hại vẫn tiếp tục gia tăng ở quốc gia này (Williamson và ctv, 1965).
Nấm B. theobromae đƣợc ghi nhận trên cây cao su tại một số nƣớc nhƣ Trung
Quốc, Ấn Độ, Malaysia nhƣng gây hại không đáng kể. Ở Philippines, nấm tấn công
trên vƣờn cây trồng mới gây ra hiện tƣợng chết ngƣợc trên vƣờn KTCB và KT gây xì
mủ. Tại Việt Nam, nấm đƣợc Vincens phát hiện trên cây cao su vào năm 1921, gây
bệnh chết ngƣợc ở giai đoạn KTCB. Barat (1931) cho biết, nấm gây hại trên cổ rễ
stump trong vƣờn ƣơng.
Tại Venezuela, L. theobromae gây ra bệnh rụng lá chồi và chết ngƣợc trên cây
thông (Pinus caribaea var. hondurensis, P. oocarpa), xoan Ấn Độ (Azadirachta
6


indica), chanh (Citrus aurantiifolia), chè (Camellia sinensis) và chanh dây (Passiflora
edulis)(Cedeno và PalaciosPru, 1992; Cedeno và ctv 1995, 1996); và cũng là một tác
nhân quan trọng của gây ra các vết sọc màu xanh trong gỗ (Mohali và ctv, 2002) làm
suy giảm chất lƣợng của gỗ thông Caribê, do đó làm giảm giá trị của nó lên đến 50%.
2.2.4. Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Hình thái nấm B. theobromae (Punithalingam, 1976)
A, B: Túi bào tử phấn, C: Những tế bào sản sinh bào tử, D: Bào tử đính

Khuẩn lạc nấm trên môi trƣờng yến mạch (oat agar) có màu từ xám nâu đến
màu xám lông chuột hoặc màu đen, trên bề mặt phủ một lớp sợi nấm mịn và dày nhƣ
lông tơ, mặt đáy có màu đen đến đen sậm. Túi bào tử phấn (pycnidia) ở dạng đơn hoặc
phức hợp, thƣờng kết hợp thành khối, bên trong chứa thể nền, có miệng nhỏ và nhiều
lông cứng, túi bào tử phấn có khi rộng đến 5 mm. Cuống bào tử đính (conidiophores)
trong suốt, đơn bào, thỉnh thoảng có vách ngăn, hình trụ ít khi phân nhánh, phát sinh từ

tử/0,01 ml) và kích thƣớc khuẩn lạc trung bình là 78 mm (Shahidul và ctv, 2001).
Số lƣợng bào tử và tốc độ phát triển của sợi nấm trên các môi trƣờng khác nhau
có sự biến thiên lớn. Theo Shahidul và ctv (2001), bào tử nấm hình thành trên môi
trƣờng Czapek’s Dox nhiều hơn trên các môi trƣờng PDA, PCM và Richard’s, sợi nấm
không phát triển trên môi trƣờng Sabouraud’s. Trong đó, khuẩn lạc có nhiều sắc tố
nhất đối với môi trƣờng PDA (75% màu đen và 25% màu trắng), ngƣợc lại ít hình
thành sắc tố trên môi trƣờng PCM (10% màu đen và 90% màu trắng). Theo
Muhammad và ctv (2006), trong các môi trƣờng PSA (potato sucrose agar), WA
(water

agar), CZA (Czapek’ s Dox agar), CMDA (corn mealdextrose agar), PCA

(potato carrot agar), CMA (corn meal agar) và YEMA (Yeast Extract Manitol Agar)
thì 3 môi trƣờng PSA, CMDA và YEMA là thuận lợi nhất cho sợi nấm B. theobromae
8


phát triển. Ở nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc nấm trên 3 môi trƣờng này đã mọc đầy đĩa petri
chỉ sau 5 ngày cấy. Trong đó, số lƣợng túi bào tử phấn trên môi trƣờng YEMA là
nhiều nhất, PCA và CMA có số lƣợng túi bào tử phấn ít hoặc không có.
2.2.6. Sự xâm nhiễm, sự lây lan và khả năng tồn tại
Nấm B. theobromae là loài ký sinh vết thƣơng gây hại trên nhiều loại cây trồng
khác nhau. Nấm gây các bệnh thối thân, vỏ, củ và rễ, gây hại trên lá gây bệnh thán thƣ
và đốm lá, triệu chứng phổ biến thấy trên thân là xì mủ và vỏ nổi nhiều vết mụn nhỏ
(Trần Ánh Pha, 2009). Bào tử nấm xâm nhiễm vào cây qua vết thƣơng hoặc xâm nhập
qua vỏ cây. Nấm có khả năng sống tiềm sinh nếu gặp điều kiện môi trƣờng bất lợi.
Ngoài cây cao su, nấm còn ký sinh trên nhiều loại cây khác nhau, chủ yếu là cây thân
gỗ (Phan Thành Dũng, 2004).
Theo Punithalingam (1976), từ những vết bệnh thối rữa trên cây, bào tử nấm
B. theobromae phát tán nhờ gió và nƣớc. Nấm có khả năng lƣu tồn qua hạt giống của

vô tính (dvt) bảng 1 khuyến cáo cho vùng Đông Nam Bộ, gậy hại nặng ở một số Công
ty Cao su nhƣ Bình Long (gây chết mắt ghép trên vƣờn ƣơng và vƣờn cây trồng mới,
chết chồi trên dvt PB 260 và RRIV 4), Tây Ninh (trên vƣờn cây KTCB của dvt RRIV
4), Phƣớc Hòa (stump bầu có tầng lá dvt PB 255), Đồng Nai (stump bầu có tầng lá dvt
PB 260, trên vƣờn cây KT của dvt PB 235 và VM 515), Phú Riềng (gây hại trên vƣờn
cây KTCB dvt RRIV 4) (Trần Ánh Pha, 2009).
2.3.2. Triệu chứng bệnh
Vƣờn stump trần: Nấm bệnh tấn công gốc gh p xuất hiện những nốt mụn nhỏ
sau đó liên kết lại với nhau làm vỏ sần sùi, ít nhựa và khó bóc vỏ khi gh p gây ảnh
hƣởng đến tỷ lệ sống. Bệnh xuất hiện tại vị trí mắt gh p, bắt đầu vào thời điểm mở
băng, gây ra hiện tƣợng chết lại mắt gh p.
Stump bầu và vƣờn tái canh – Trồng mới (TC-TM): Bệnh xuất hiện trên chồi có
triệu chứng ban đầu với vết l m có màu đậm hơn, sau đó lan rộng và chết khô toàn bộ,
vỏ bị chết xuất hiện những đốm nhỏ màu đen chứa nhiều bào tử. Phần gỗ bị chết có
màu trắng với những vân nhỏ màu nâu đen (là khuẩn ty xâm nhiễm vào gỗ), vỏ chết
khó tách khỏi gỗ.
Vƣờn nhân: Xuất hiện những nốt mụn nhỏ trên vỏ xanh nâu, sau đó liên kết lại
với nhau làm khó bóc vỏ khi gh p và ít nhựa gây ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống. Đây là
nguồn nấm có thể lây lan sang gốc gh p và gây ra hiện tƣợng chết lại mắt gh p.
Vƣờn cây 1 – 2 năm tuổi (trên vỏ xanh nâu): Trên chồi với vết nứt có dạng hình
thoi sau đó phát triển theo hƣớng lên trên và xuống dƣới, tại vết bệnh có hiện tƣợng
mủ rĩ ra sau đó bị hóa đen do hiện tƣợng oxy hóa, phần vỏ và gỗ bị khô và xốp. Khi

10


vết bệnh lan rộng, tán lá non sẽ khô và h o rũ nhƣng không rụng, trên phần vỏ bị chết
xuất hiện những đốm có màu nâu đen chứa nhiều bào tử.
Vƣờn cây từ 3 năm tuổi trở lên (vỏ hoá nâu) và vƣờn cây kinh doanh: Ban đầu
xuất hiện những nốt mụn nhỏ 1 – 2 mm, sau đó lan ra toàn bộ thân cành. Các nốt này

super 250 EC 0,2%

BDNH 2000

BDNH 2000 nồng độ 1%; (3) TILUSA

BDNH 2000 nồng độ 1%.

2.4. Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.1. Khái niệm đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự khác biệt về đặc điểm di truyền giữa các loài, giữa các
quần thể cách ly nhau về mặt địa lý cũng nhƣ giữa các các thể cùng chung sống trong
một quần thể.
Sự biến đổi di truyền giữ một vai trò quan trọng đối với khả năng đối phó, tồn
tại của loài và quần thể trƣớc những thay đổi của các yếu tố môi trƣờng. Không có
sinh vật nào dự đoán trƣớc đƣợc tƣơng lai, cũng không có sinh vật nào có khả năng
thích ứng tốt với tất cả điều kiện môi trƣờng. Tuy nhiên, cấu trúc di truyền hiện có của
một loài có ảnh hƣởng đến khả năng thích nghi với các điều kiện môi trƣờng trong
tƣơng lai của các cá thể trong loài. Tính đa dạng cao thì khả năng thích ứng với sự
biến đổi của điều kiện môi trƣờng càng lớn.
2.4.2. Trình tự ribosomal DNA – Internal Transcribed Spacer (rDNA – ITS)
rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu phát sinh loài. rDNA đƣợc quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có
nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên
tiếp trên một locus và liên quan mật thiết với quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom hầu
nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA
tƣơng đối bảo tồn nên đƣợc xem là cở sở để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt khi
13



tính riêng. Trực tiếp giải trình tự rDNA đƣợc thực hiện để thu đƣợc trình tự nhanh
chóng. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần một lƣợng DNA tƣơng đối lớn và có thể dẫn
đến sai lệch bởi vì chỉ duy nhất 1 chuỗi đƣợc giải trình tự. Việc thực hiện phản ứng
PCR và giải trình tự DNA trực tiếp cho một vài thuận lợi hơn so với việc tạo dòng
(cloning) và giải trình tự DNA trực tiếp. Phƣơng pháp này dùng DNA tổng số từ bộ
gen với một lƣợng rất nhỏ (0,1 – 10 ng cho một phản ứng khuếch đại); cả hai mạch
đơn của gen đều có thể đƣợc dùng để giải trình tự nhằm hạn chế bớt sai sót; và phƣơng
pháp này có thể thích hợp với các thiết bị giải trình tự DNA tự động sử dụng các trình
tự mồi có đánh dấu huỳnh quang hay dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP) (White
và ctv, 1990).
Các mồi ITS đƣợc thiết kế để khuếch đại các đoạn khác nhau của vùng ITS nằm
giữa các gen 18S, 5,8S, và 28S (White và ctv, 1990) (Hình 2.7). Trong số các mồi ITS,
cặp mồi ITS1 và ITS4 đã khuếch đại từ đầu 3’ của rDNA 18S tới đầu 5’ của rDNA
28S, bao gồm cả vùng ITS1, 5,8S rDNA và ITS2 (đƣợc biết đến nhƣ là vùng rDNA –
ITS) đã đƣợc sử dụng rộng rãi (Vilgalys, 2008).

Hình 2. 6 Vị trí bắt cặp của các mồi ITS (internal transcribed spacer), các mồi dùng để
giải trình tự đƣợc tô đậm (Nguồn: Vilgalys và ctv, 1992).
Vùng rDNA – ITS đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1
và ITS4. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc giải trình tự và trình tự nucleotide sẽ đƣợc so
15