VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYM
NHẰM ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngư ời hư ớng dẫn k hoa h ọc: TS. Ng u yễ n Th ế Trang

Hà Nội, tháng 12 năm
2014
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

1



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học, hóa lý và sinh học. Đối v ới nước thải hữu
cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, có
nhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh tê và ky thuật . Trong các nghiên cứu xử lý nước thải
thì việc dùng biện pháp sinh học đang là ưu tiên hàng đầu. Viêc phân huy chât hưu cơ
dưa trên cac vi sinh vât tư nhiên co săn trong nươc thai con găp nhiêu han ch ế như thời
gian phân hủy lâu, quá trình phân huy chưa triêt đê. Do đo, cân tuyên chon nhưng chung
vi sinh vật (VSV) thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quá
trình xử
lý đạt kết quả tốt hơn [1]. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số
chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trong
xử lý nước thải hữu cơ” được thưc hiện là cần thiết.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

3

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1 . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ
GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới
Sư phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm đầu
thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi trường trong
suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy trình xử lý nước
thải. Gilbert Fowler và cộng sư tại Đại học Manchester được tiến hành tại Trạm Thí
nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí vào nước thải trong bình


K16

4

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng đồng
chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượt quá 2,18
mg/l [4].
Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã sử
dụng chủng nấm men Candida utlis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại đường và
axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy sau 96 giờ
xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH tăng từ 3,5 lên 8,5 [36].
Môt sô kêt qua nghiên cưu xư ly nươc thai chăn nuôi lơn băng qua trinh SBR hoăc tương
tư đươc tông hơp : Trong nghiên cứu của Bortone G. (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N
của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá cao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 %.
Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao
3
3
lần lượt là 0,37 kg/(m .ngày) và 0,13 kg/(m .ngày) [28]. Nghiên cứu của Chang
Won Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 %. Tải trọng
3
3
COD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m .ngày) và 0,2 kg/(m .ngày) [29]. Quá trình sục khí luân
phiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) cho hiệu quả xử lý khá
cao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31]. Nghiên cứu của Mohammad N. (2011) với quá
trình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34].
Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả (2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với


+

trong môi

trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép
QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thưc vật thủy sinh là
là 0,2 mg/l [17].
Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước.
Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 ÷ 594 mg/l, trong
đó NH3 từ 304 ÷ 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62 mg/l [6]. Ngày
nay, cùng với sư phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia tăng, nước rỉ rác từ
các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người dân
xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh khu vưc. Tổng hàm
lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong khoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng
amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [11].
Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia nhập
WTO, cùng với sư phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất nước, chất
thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về chủng loại và
đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng đắn và đầu tư thích
đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý nước thải bị ô nhiễm các
hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử dụng các biện pháp sinh học,
trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là phổ biến nhất, với nguồn nước thải
có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí. Kết quả
nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng
sư cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16


chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của Phạm Thị
Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện vận hành
như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và chế độ sục khí đến
hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thải chăn nuôi đã qua xử lý
kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạt
khá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷
85 % [12]. Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổi
trong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá trình
nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo Phan Đỗ
Hùng và cộng sư cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả xử lý của quá
trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh với chế độ cấp nước
một lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp nước hai lần là một giải pháp
để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thưc
nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

7

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng, tuy
nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất xử lý T-N ở
cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao nhất, trong
khoảng 85 ÷ 90 %. Hiệu suất xử lý T-N thưc nghiệm ở các tỉ lệ cấp nước thấp 1/2 và
2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở chế độ cấp nước hai lần
cũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với trường hợp cấp nước một lần [5].
1.2. THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƢỚC THẢI HỮU CƠ


gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tư cao, rất bền vững và vùng vô định hình kém trật tư
và bền vững hơn. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh
mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sư trương này. Xenluloza có cấu trúc đặc, bền
chắc cùng với sư có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho sư xâm nhập của enzym
vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước của chuỗi β-1-4-glucan, làm cản
trở tốc độ của phản ứng thủy phân.
Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng số
hydratcacbon tư nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thân cây,
cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Hình 1.1. Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]
Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro
Xenluloza có cấu trúc rất bền vững. Không tan trong nước, không bị tiêu hóa trong
đường tiêu hóa của người và động vật. Trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có
nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza.
1.2.2. Hemixenluloza trong nƣớc thải
Trong tế bào thưc vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Trong thành
phần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên của chúng
thường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thành phần của
chúng. Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so với xenluloza, thường
chúng chỉ có khoảng 150 gốc đường. Các gốc đường đơn này được nối với nhau bằng các
liên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit. Các hemixenluloza thường tạo mạch ngắn và phân
nhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽ dễ bị phân giải bởi
axit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giải
trong nước nóng [30].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16


và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô
thị của khu vưc nhiệt đới. Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

10

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


ra môi trường. Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại được
Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu diệt.
Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não. Số lượng của
chúng tương đối thấp hơn enteroviruses. Người ta đã chứng minh được rằng việc loại bỏ
các loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ lửng. Ngoài vi sinh vật
gây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh ký sinh trùng chủ yếu là do
Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này có kích thước lớn (45  70 m  35
 50 m).
1.3. VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƢỚC THẢI HỮU CƠ
1.3.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza
Xenlulaza đươc thu tư nhiêu nguôn nguyên liêu khac nhau như đông vât (các
nhóm thân mềm, lơn, bò, gà); thưc vât (trong hat ngu côc nay mâm la đai mach , yên
mạch, lúa mì, mạch đen ) và vi sinh vật (nâm sơi , nâm men , xạ khuẩn và vi khuẩn ). Tuy
nhiên, vi sinh vât la nguôn thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đươc nhiêu
lân trong năm va chu đông sư dung nguôn nguyên liêu re tiên đê
dàng điều khiể n co đinh hương nguôn enzym

nuôi cũng như dễ


Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas,
Nitrozocystc, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt buộc
[3].
1.3.4. Vi sinh vật phân giải tnh bột
Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn Bacillus,
Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi sinh vật có khả
năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza. Ví dụ như một số vi nấm bao gồm
một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium ... Xạ khuẩn cũng có một số chỉ có khả
năng phân hủy tinh bột. Đa số các vi sinh vật đều không có khả năng tiết ra một hoặc vài
enzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ra môi trường [3].
1.4. THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƢỚC BỊ Ô NHIỄM
Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chung thì có
rất nhiều các thông số. Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất có trong đó mà
ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn cho phép về thành
phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các mục đích khác nhau.
Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ là: pH, độ đục, các chất
rắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và COD có ý nghĩa rất quan trọng.
Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn ky thuật quốc gia về nước thải công nghiệp, một
số thông số ô nhiễm trong nước thải công
nghiệp (bảng 1.1).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

12

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật




Chất rắn lơ lửng

mg/l

50

100

COD

mg/l

75

150

BOD5

mg/l

30

50

Tổng nitơ

mg/l

20

 Màu sắc
Nước bình thường không có màu, nước trong các ao hồ có thể có màu tùy thuộc
vào các chất có mặt trong đó. Nước thải thường có màu nâu đen, đỏ hoặc đỏ nâu. Màu
sắc của nước là do các chất hữu cơ, vô cơ có mặt trong nước gây nên. Màu sắc của
nước ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khi sử dụng nước có màu trong sản xuất [16].
Màu của nước là do:
+ Các chất hữu cơ và phần chết của thưc vật gọi là màu thưc vật, màu này rất
khó xử lý được bằng phương pháp đơn giản. Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh.
+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý.
Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây là
phương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban. Cường độ màu
của nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16].
 Mùi của nước
Nước tư nhiên sạch không mùi, nước thải và nước ô nhiễm thường có mùi khó
chịu từ nhẹ đến hôi thối.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

13

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nước chứa
trong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửi mùi và đánh
giá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng. [16]
 Độ pH
pH cua nươ c thai có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý . Các công trình



Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặc không
tan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng. Các chất hữu cơ như xác các vi sinh vật, tảo,
động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợp như phân bón, các
chất thải công nghiệp.
Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng
lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở
o
105 C cho đến khi trọng lượng không đổi. Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l). Chất rắn lơ
lửng ở dạng huyền phù (SS). Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khô của chất
rắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh. Chất rắn hòa tan (DS). Hàm lượng chất rắn hòa tan
chính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS. Đơn vị tính bằng g (hoặc
mg) [22].
 Hàm luợng nitơ
+
Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4 ), nitrat
(NO3 ), ít hơn ở dạng nitrit (NO2 ) và trong một số hợp chất hữu cơ khác. Thành phần
được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi
trường là khí nitơ (N2).
Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng khác
đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng lượng hoặc
để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sư phát triển của chúng. Các dạng nitơ
hữu cơ từ nguồn động thưc vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa
+
+
thành dạng NH4 ; sau đó NH4 được chuyển hóa thành NO2 nhờ vi
khuẩn nitrit hóa; NO2 sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3;
cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá trình
khử nitrat.

photpho bằng phương pháp sinh học dưa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích
lũy lượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông
thường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bào khô,
một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14].
Nghiên cứu Van Bethum và cộng sư, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vật được
tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat. Trong cơ thể của chúng, photphat có thể chiếm
đến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat, và với vi khuẩn
không tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng tế bào [3].
 Chỉ số vệ sinh (E. coli)
Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thưc tế các bệnh lây lan qua môi
trường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

16

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


vong, nhất là ở các nước đang phát triển. Các tác nhân gây bệnh thường được bài tiết
ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các vi khuẩn,
virus, động vật đơn bào, giun kí sinh. Chất lượng về mặt vi sinh của nước thường được sử
dụng rộng rãi nhất là chỉ số E. coli [20].
1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SƢ SINH TRƢƠNG CUA VI SINH VÂT TRONG QUA
TRINH XƢ LY NƢƠC THAI
1.5.1. Ảnh hƣơng cua nƣơc va nông đô cac chât dinh dƣơng
Nươc đong vai tro rât quan trong trong hoat đông sông cua vi sinh vât . Nươc hòa
tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng



17

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


1.5.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
Cũng tương tư như nhiệt độ , pH môi trường ban đầu cũng là yếu tố ảnh
hương lơn đên tôc đô sinh trương cua vi sinh vât . Phân lơn ca c vi sinh vât co pH sinh
trưởng tôi ưu tư 5,5 ÷ 7,5 có một số loài sinh trưởng tôi ưu ơ pH thâp (< 4,5) và môt sô
loai sinh trưởng tôi ưu ơ pH kiêm . Ở pH không thich hơp hê enzym của vi sinh vât hoat
đông yêu hoăc bi bât hoa t do đo anh hương trưc tiêp đên qua trinh trao đôi chât cua vi
sinh vât . Đê vi sinh vât sinh trương tôt cân duy tri pH thich hơp trong suôt thơi gian nuôi
cây.
1.5.4. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan
Môi quan hê cua vi sinh vât đôi vơi o xy rât khac nhau . Vi sinh vât hiêu khi cân oxy
đê sinh trương . Vi sinh vât yêm khi oxy lai la tac nhân gây đôc . Nhóm vi sinh vât trung
gian giưa hai nhom nay la nhom hiêu khi tuy tiên .
Trong xư ly nươc thai ơ cac bê a eroten cân cung câp đu oxy đê vi sinh vât hiêu
khi oxy hoa cac chât hưu cơ co trong nươc thai

. Còn xử lý yếm khí thì tiến hành trong

các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi sinh vât yêm khi
[23].
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ NƢỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ
Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinh
học, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa.
Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụng nhiều
với hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bị phân hủy,

Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồn dinh
dưỡng và tạo năng lượng. Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinh dưỡng để
xây dưng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng được tăng lên. Quá
trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa [8].
Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉ tiêu
COD hoặc BOD. Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần không chứa các
chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng không được vượt
quá nồng độ cưc đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥
0,5.
1.7. TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ
Xư ly nươc thai băng phương phap sinh hoc chu yêu dưa vao hoat đông sông của
các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giai chât hưu cơ . Các vi sinh vật dị
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

19

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


dương co t hê chia thanh ba nhom nho : Vi sinh vât hiêu khi , vi sinh vât yêm khi va vi sinh
vât tuy nghi . Khu hê vi sinh vât sư dung trong qua trinh xư ly nươc thai gôm vi khuân ,
nâm me n, nâm môc , xạ khuẩn ... Trong đo , vi khuân chiêm sô lương lơn nhât. Trong cac
bê xư ly sinh hoc , vi khuân đong vai tro quan trong hang đâu vi no chịu trách nhiệm phân
hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải . Do vây, bên cạnh viêc lơi dụng nhưng tính
năng ưu viêt của các loài vi sinh vât thì chúng ta cân phải lưa chọn nhưng chủng vi sinh
vât thích hơp vưa có khả năng làm sạch, vưa tạo đô kêt lăng tôt vưa không gây đôc hại
cho môi trương. Các tiêu chí đươc xét: Có hoạt tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phân
giải hữu cơ cao, ổn định. Sinh trưởng tốt trong điều kiện thưc tế của nước thải hữu cơ,

(Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D- glucoza,
saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl, KH2PO4,
MgSO4.7H2O, KNO3 …
+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB
đ
+ Bộ kit TOPO TA Cloning bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình tách
đ
đ
dòng: Vectơ pCR 2.1-TOPO , enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dung dịch đệm
cho từng loại enzym.
+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tư, sử dụng bộ
sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

21

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Pr16R:
TACGGTTACCTTGTTACCGACTT
- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET
(Singapore BioTech pte, Ltd).
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000 ml; pH
7.
Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

22

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


 Nhuộm Gram vi khuẩn [3]
Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu thuốc
nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-), màu tím là Gr
(+).
 Đặc điểm sinh lý, sinh hoa
 Khả năng sinh tổng hợp enzym
Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung thêm
o
1 % tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30 C trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi
khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi
khuẩn sinh trưởng [3].
Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bột giấy.
o
Nuôi ở nhiệt độ 30 C trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có
khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩn
sinh trưởng.
Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở nhiệt
o
o
độ 30 C, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 C để trong 2 giờ. Sau 2 giờ môi trường
trong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng gelatin.
 Khả năng sư dung cac nguôn cacbon


và

hypochlorit với sư có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất indophenol blue.
So màu ở bước sóng 640 nm [9].
*

Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2 ) thành nitrat (NO3 ) của các chủng được đánh
giá thông qua sư giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy. Phản ứng giữa nitrit
và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước
sóng 540 nm [9].
*

Đánh giá khả năng tch lũy photpho

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượng photphat
còn lại trong môi trường. Hàm lượng photphat được đánh giá dưa trên nguyên tắc tạo
phức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatrat thành một phức chất
màu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11].
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn
Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao
o
nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 C sau 24 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ở
các đường giao nhau [3].
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn
+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi môi
trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sư thay đổi của các tế bào vi sinh vật. Vì vậy,
sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm lượng enzym

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường cơ sở
có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và (NH4)2SO4.
Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra
sư sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).
2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym
Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;
1.5; 2 và 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp xỉ
nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ
o
chất, mix đều và ủ ở 37 C trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi các
mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau đó làm lạnh bằng
cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu
tiếp.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

25

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật