BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: LÊ DUY HOÀNG CHƯƠNG

Tháng -i9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:


Tháng 9 năm 2008
Lê Duy Hoàng Chương

-ii-


TÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn cố định nitơ trên cây họ Đậu” được thực hiện
tại trại Thực nghiệm sinh học, phòng Sinh học phân tử - Lab B, trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008.
* Mục tiêu đề tài:
 Phân lập những chủng vi khuẩn Azospirillum sp. và vi khuẩn Bradyrhizobium sp.
trên môi trường chọn lọc NFb, CRA và YEM, YEMA.
 Tuyển chọn những chủng phân lập về khả năng cố định nitơ và kích thích thực vật
tăng trưởng.
 Định danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA
kết hợp với một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
* Kết quả:
 Phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng được trên các môi
trường chọn lọc từ nguồn mẫu là rễ cây họ Đậu có nốt sần và đất ở vùng rễ được
lấy ở Thủ Đức và vườn Quốc gia Nam Cát Tiên.
 Chọn lọc được 8 chủng vi khuẩn vừa có khả năng cố định nitơ, vừa có khả năng
phân tiết các loại phytohormone kích thích thực vật tăng trưởng.
 Định danh được 8 chủng vi khuẩn thuộc 8 loài của 5 chi vi khuẩn cố định nitơ khác
nhau bao gồm: Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella
oslensis, Bacillus acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia và
Klebsiella sp.
 Xác định môi trường NFb và CRA không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn
Azospirillum sp. và môi trường YEM không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn
Bradyrhizobium sp.

nitrogen-fixing bacteria or plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) such as
Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella oslensis, Bacillus
acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia and Klebsiella sp.
 Drew the conclusion of the imperfectly selective NFb or CRA media for
Azospirillum sp. and the incompletely selective YEM and YEMA ones for
Bradyrhizobium sp.
 The degenerated PolF-PolR and nifHfor-nifHrev primers were not specific for nifH
genes of 8 defined strains.
-iv-


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................i
TÓM TẮT ......................................................................................................................... iii
SUMMARY........................................................................................................................iv
MỤC LỤC ..........................................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ.............................................................................................ix
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ xii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ...................................................................................xiv
Chương 1 MỞ ĐẦU..........................................................................................................15
1.1

Đặt vấn đề .............................................................................................................15

1.2

Phân loại ...............................................................................................................20

2.4.2

Đặc điểm...............................................................................................................20

2.4.3

Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên..................................................22

2.5

Vi khuẩn chi Azospirillum ....................................................................................23

2.5.1

Lịch sử phát hiện ..................................................................................................23

2.5.2

Phân loại ...............................................................................................................24

-iv-


2.5.3

Sự phân bố ............................................................................................................26

2.5.4


2.6.4.1 Khả năng cố định nitơ...........................................................................................35
2.6.4.2 Vai trò và ứng dụng ..............................................................................................37
2.7

Gene nif.................................................................................................................37

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................38
3.1

Bố trí thí nghiệm...................................................................................................38

3.2

Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................38

3.2.1

Mẫu thí nghiệm.....................................................................................................38

3.2.2

Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................................38

3.2.3

Hóa chất ................................................................................................................39

3.2.3.1 Các loại môi trường dùng cho thí nghiệm ............................................................39
3.2.3.2 Một số hóa chất khác ............................................................................................40


3.3.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin...............................................................47
3.3.4.2 Xác định hoạt tính Cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên tử diệp
dưa chuột...............................................................................................................49
3.3.4.3 Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên hạt
xà lách ...................................................................................................................50
3.3.5

Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân
tích trình tự 16S rDNA .........................................................................................52

3.3.5.1 Ly trích DNA bộ gene vi khuẩn ...........................................................................52
3.3.5.2 Khuếch đại trình tự rDNA 16S của vi khuẩn bằng phản ứng PCR ......................54
3.3.5.3 Gửi mẫu giải trình tự và xử lý kết quả giải trình tự..............................................56
3.3.6

Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR .....................................56

3.3.7

Thí nghiệm 7: Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa..................................58

3.3.7.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý .........................................................................58
3.3.7.2 Khảo sát một số đặc điểm sinh hóa ......................................................................60
3.3.7.3 Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ..........................................63
3.3.8

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng định danh ........................65

3.3.9


4.4

Thí nghiệm 4: Định tính và định lượng các loại phytohormone thô có trong dịch
khuẩn.....................................................................................................................75

4.4.1

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin...............................................................75

4.4.2

Định lượng auxin thô, cytokinin thô và gibberellin thô .......................................76

4.5

Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân
tích trình tự 16S rDNA của vi khuẩn....................................................................79

4.5.1

Kết quả tách chiết DNA bộ gene vi khuẩn ...........................................................79

4.5.2

Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu.........................80

4.6

Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR .....................................82

5.1

Kết luận...............................................................................................................113

5.2

Đề nghị................................................................................................................114

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................115
PHỤ LỤC

-vii-


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACC

1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

BA

6-Benzyladenin

bp

base pair

CTAB

Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide


Giberrellic acid

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

kg

kilogram

LB

Luria Bertani

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

PHB

Poly-β-hydroxybutyrate



DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình

Trang

Hình 2.1 – Hoa của một cây họ Đậu ...............................................................................18
Hình 2.2 – Chu trình nitơ trong tự nhiên..........................................................................19
Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật ........................................................22
Hình 2.4 – Cây phát sinh loài (phylogenetic tree) của Azospirillum ...............................26
Hình 2.5 – Mô hình về sự tương tác giữa Azospirillum và rễ thực vật ............................29
Hình 2.6 – Cơ chế tạo nốt sần của Bradyrhizobium sp....................................................36
Hình 2.7 – Leghaemoglobin..............................................................................................36
Hình 3.1 – Các bước nhuộm Gram...................................................................................44
Hình 3.2 – Khoảng đổi màu của Bromothymol blue ........................................................45
Hình 3.3 – Vị trí bắt cặp các mồi trên trình tự 16S rDNA ...............................................54
Hình 3.4 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA ......................55
Hình 3.5 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch gene nifH ..........................................57
Hình 3.6 – Sự chuyển màu của dung dịch chuẩn độ từ tím đỏ sang vàng cam ................65
Hình 4.1 – Các ống nghiệm môi trường NFb sau 5 ngày tăng sinh.................................67
Hình 4.2 – Các ống nghiệm môi trường YEM sau 5 ngày tăng sinh ................................68
Hình 4.3 – Dịch khuẩn chủng 4415b có NH4+ làm đổi màu giấy quỳ ẩm thành xanh .....74
Hình 4.4 – Màu hồng do thuôc thử Salkowski phản ứng với auxin do chủng 4415b tiết ra
trên giấy lọc có sinh khối vi khuẩn.............................................................................75
Hình 4.5 – Sự khác biệt giữa tử diệp được xử lý với cytokinin thô và nước cất
(đối chứng – ĐC)........................................................................................................77
Hình 4.6 – Hình điện di DNA bộ gene của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu.......................79
Hình 4.7 – Kết quả điện di sản phẩm PCR DNA bộ gene 8 chủng nghiên cứu với cặp mồi
27F – 1525R ...............................................................................................................81

Klebsiella có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát .....106
Hình 4.23 - Cây phát sinh loài của chủng 4560 với các chủng chuẩn thuộc chi
Burkholderia.............................................................................................................108

-x-


Sơ đồ

Trang

Sơ đồ 3.1 – Quy trình thí nghiệm .......................................................................................41
Sơ đồ 3.2 – Quy trình tách chiết các phytohormone từ dịch nuôi cấy vi khuẩn theo
phương pháp ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật........................51
Sơ đồ 3.3 – Quy trình ly trích DNA bộ gene vi khuẩn theo phương pháp CTAB ..............53

-xi-


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 – Các cơ chế kích thích thực vật sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ ở
vùng rễ ........................................................................................................................23
Bảng 2.2 – Các loài Azospirillum sp. đã được định danh (nguồn từ NCBI) ....................24
Bảng 2.3 – Độ tương đồng di truyền trình tự 16S rDNA của các loài
Azospirillum sp. ..........................................................................................................25
Bảng 2.4 – Sự phân bố của Azospirillum sp. ....................................................................27

Bảng 4.12 – Kết quả khảo sát nhiệt độ của 8 chủng nghiên cứu......................................90
Bảng 4.13 – Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên kit IDS 14GNR của 8 chủng nghiên cứu92
Bảng 4.14 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 5 chủng nghiên cứu phân
lập trên môi trường CRA ............................................................................................93
Bảng 4.15 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý sinh hóa của 3 chủng nghiên cứu
phân lập trên môi trường YEMA ................................................................................94
Bảng 4.16 – Kết quả định lượng nitơ tồng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng
phương pháp Kjeldahl ................................................................................................95
Bảng 4.17 – Độ dài trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu sau khi giải trình tự ....96
Bảng 4.18 - Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn
đã được công bố trên NCBI........................................................................................97
Bảng 4.19 – Độ tương đồng di truyền của các chủng 4415b, 4485, 4487 với những có
mối quan hệ gần nhất ...............................................................................................101

-xiii-


DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 4.1 - Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của 8 chủng vi khuẩn........................90
Biểu đồ 4.2 – Lượng nitơ tổng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu ...............................95
Đồ thị

Trang

Đồ thị 4.1 – Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ IAA và OD530nm .......................76
Đồ thị 4.2 – Đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột

trước đây đã nghiêm cấm việc trồng thực vật biến đổi gene thì giờ đây đang xem xét việc
tiến hành trồng đại trà và phổ biến những cây trồng biến đổi gene. Những giải pháp trên
tuy đem lại hiệu quả nhanh chóng trước mắt trong việc cải thiện năng suất, gia tăng phẩm
chất cây trồng; tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như gây ô nhiễm môi
trường, thoái hóa đất nông nghiệp, ảnh hưởng xấu đến sự đa dạng sinh học và tác động
tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài ra, do tình trạng ô nhiễm môi trường
hiện đang là vấn đề chung cấp bách của các quốc gia trên thế giới nên việc xây dựng một
nền nông nghiệp năng suất cao nhưng bền vững và thân thiện với môi trường đã trở thành
một xu hướng mới trên toàn cầu. Và việc nghiên cứu về sự tương tác có lợi giữa vi sinh
vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để gia tăng phẩm chất cây lương thực hứa hẹn
nhiều tiềm năng; trong đó vi khuẩn cố định nitơ là đối tượng điển hình. Bên cạnh khả
năng cố định nitơ để thực vật hấp thu giúp tăng hàm lượng đạm cho cây, một số vi khuẩn
cố định nitơ như Azospirillum, Herbaspirillum, Bradyrhizobium, Pseudomonas,
Gluconoacetobacter,… còn có khả năng phân tiết ra các chất kích thích tố thực vật –
-15-


phytohormon, sản xuất siderophore, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế
sự phát triển của mầm bệnh; qua đó, kích thích sinh trưởng thực vật. Trong đó, các loài
Azospirillum là những vi khuẩn cố định nitơ đầu tiên được phân lập từ rễ thực vật thân
thảo và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực
vật; cũng như Bradyrhizobium sp. là những loài vi khuẩn quang dưỡng ở rễ cây họ Đậu,
mang nhiều đặc tính ưu việt của chi vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh.
Trên thế giới, vi khuẩn cố định nitơ đã được nghiên cứu vào khoảng đầu thế kỷ 19,
mặc dù vậy, tiềm năng ứng dụng của chúng vẫn chưa được khám phá hết. Ở nước ta, việc
nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ đã phổ biến và hiện nay trên thị trường phân bón trong
nước đã có nhiều chế phẩm phân vi sinh cố định đạm ra đời. Tuy nhiên, việc nghiên cứu
vi khuẩn cố định nitơ ở nước ta chỉ tập trung vào những giống phổ biến, có khả năng cố
định nitơ mạnh như Rhizobium, Azotobacter mà ít nghiên cứu những giống khác ngoài
khả năng cố định nitơ còn có tác dụng kích thích sinh trưởng cây trồng. Ngoài ra, nguồn

lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có
thu hoạch [63], [64].
2.2

Thực vật họ Đậu
Thực vật họ ĐậU, tên khoa học Leguminosae (Fabaceae) – là họ lớn thứ 2 của thực

vật có hoa với 650 chi và 18000 loài. Nhiều cây trong họ này làm lương thực cho con
người và gia súc như cây Đậu Hà-lan, Đậu cô-ve, Đậu tương… hoặc làm phân xanh như
cỏ ba lá, muồng. Ngoài ra một số cây trong họ này được dùng trong mục đích cải tạo đất
bị thoái hóa, phục hồi, cải tạo môi trường sinh thái như keo, bồ kết ba gai. Một số chi
trong họ này như Mimosa, Delonix, Acacia… là các loại cây cảnh. Đặc biệt, một số loài
còn có tính chất dược học hoặc diệt trừ sâu bọ.
Một đặc điểm nổi bật của các loài cây thuộc họ Đậu là chúng là các loại cây ký chủ
cho nhiều loài vi khuẩn cố định nitơ ở rễ của chúng [67].

-17-


Trong giới Thực vật, vị trí phân loại của các cây
họ Đậu như sau:
 Ngành: Magnoliophyta (hạt kín)
 Lớp: Magnoliopsida (2 lá mầm)
 Bộ: Fabales
 Họ: Fabaceae
Hình 2.1 – Hoa của một cây họ Đậu [81]
2.3

Quá trình cố định nitơ


có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử
hay thành phần II. Thành phần kia gọi là protein sắt – molybden (Mo-Fe protein) còn gọi
là thành phần I. Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đếu rất mẫn cảm với oxy,
vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [9].

-19-


Sự cố định nitơ sinh học có thể xảy ra trên nhiều đối tượng trong tự nhiên như tảo
lam, địa y và vi sinh vật sống tự do trong đất. Tuy nhiên, sự cố định nitơ ở những sinh vật
này chỉ cung cấp một lượng đáng kể NH3 cho hệ sinh thái tự nhiên mà hầu hết không có ý
nghĩa nhiều đối với ngành nông nghiệp. Chúng cung cấp khoảng dưới 5kg nitơ/hecta một
năm. Trong khi đó, sự cố định nitơ ở cây họ Đậu cung cấp khoảng từ 28kg đến 84kg nitơ/
hecta một năm ở hệ sinh thái tự nhiên, và khoảng vài trăm kg trong ngành
nông nghiệp [43].
2.4

Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

2.4.1 Phân loại
Vi khuẩn cố định nitơ được phân thành 3 nhóm nhỏ: vi khuẩn sống cộng sinh, vi
khuẩn sống tự do và vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ. Tuy nhiên, sự phân biệt giữa
3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định nitơ
tương tác với thực vật thì vẫn chưa được được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn
được xếp vào nhiều nhóm [54].
2.4.2 Đặc điểm
- Vi khuẩn sống cộng sinh là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ
theo kiểu 2 bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh
dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình
là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ ĐậU. Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn

khuẩn sang cây trồng. Một số chi vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác
điển hình như: Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter,
Herbaspirillum, và Klebsiella.

-21-


Vi khuẩn cộng sinh cư trú ở vùng gian bào
(Endosymbionts)
Sự gia tăng
độ mật
thiết các
tương tác
của vi
khuẩn cố
định nitơ
với thực vật

Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh tạo nốt sần trên rễ cây họ Đậu.
Vi khuẩn cư trú ở vùng ngoại bào (Ectosymbionts)
Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật bậc
thấp.
Vi khuẩn bên trong mô cây chủ (Endophytes)
Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía.
Vi khuẩn chỉ sống trên bề mặt cây
Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella cư trú ở vùng rễ thực vật.

Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật [54]
2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định

phát hiện một chủng vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có
nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn. Ông nhận thấy rằng khi dùng môi trường
trên để nuôi cấy chủng vi khuẩn mới này thì có sự gia tăng hàm lượng nitơ, trong khi đó,
trong môi trường không có chủng này thì không có biểu hiện như vậy. Do chủng vi khuẩn
này dễ nuôi cấy trên môi trường muối khoáng với acid hữu cơ, cũng như có hình dạng
giống với Spirillum trong những điều kiện nhất định, Beijerinck đã xem chủng này là một
thành viên của chi Spirillum và là vi sinh vật trung gian kết nối giữa chi Spirillum và
Azotobacter. Ban đầu, ông đặt tên chủng mới này là “Azotobacter Spirillum”, nhưng sau
đó lại đổi tên thành “Spirillum lipoferum”. Năm 1932, Schroder đã tiến hành nghiên cứu
lại về S. lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi chứng minh sự cố định nitơ bởi những
chủng vi khuẩn thuần, và vì thế chủng này đi vào quên lãng trong nhiều năm. Vào năm
1963, Becking đã phân lập được một vi sinh vật tương tự với S. lipoferum có khả năng cố
định nitơ rõ rệt. Mười năm sau đó, Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ

-23-