BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE
THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN
CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG
CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ.

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà
Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm
MSSV: 1311110775

Lớp: 13DTP08

TP. Hồ Chí Minh, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE
THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN
CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG
CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ.

và hoàn thành đúng thời hạn.
Ý kiến giảng viên hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

TP. HCM, ngày … tháng … năm ……….

Trưởng khoa ký duyệt

Sinh viên đăng ký

(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi. Các tài liệu
và số liệu sử dụng để phân tích trong nghiên cứu đều đã được công bố trên các tạp chí,
giáo trình theo đúng quy định. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi
tự tìm hiểu, thực hiện thí nghiệm, phân tích một cách khách quan và phù hợp với thực
tiễn. Và các số liệu của kết quả này chưa được công bố trong các nghiên cứu đã được
thực hiện trước đây.

Sinh viên thực hiện

Văn Thị Công Tâm


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học
– Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy các kiến thức cũng như sự đam mê về ngành

Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ...................................... 4

1.1.3.

Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm .................................................... 6

1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết
rút 7
1.2.1.

Carotenoid ................................................................................. 7

1.2.2.

Astaxanthin ................................................................................ 9

1.2.3.

Caotenprotein ........................................................................... 11

1.2.4.

Các ứng dụng astaxanthin: ...................................................... 13

1.3. Enzyme protease ....................................................................................... 15
1.3.1.

Giới thiệu chung về enzyme protease ........................................ 15

1.3.2.

Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................... 24

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27
2.1. Nguyên liệu cứu:......................................................................................... 27
2.1.1. Đầu tôm: ......................................................................................... 27
2.1.2. Enzyme protease: ............................................................................ 27
2.1.3. Hoá chất ......................................................................................... 27
2.2. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 27
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 29
2.3.1.

Nội dung nghiên cứu ................................................................ 29

2.3.2.

Bố trí thí nghiệm ...................................................................... 30

ii


Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự
trình bày trong hình 2.2.............................................................................. 30
2.3.3.

Phương pháp nghiên cứu: .......................................................... 37

2.3.4.

Xử lý số liệu: ............................................................................. 37


3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân .................... 61
3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân ................................ 61
3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định
nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein.
................ ........................................................................................................ 62
3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ,
nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin .................................... 62
3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và
thời gian tới thu hồi astaxanthin. ..................................................................... 65
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 70
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 70

iv


4.2. Kiến nghị........................................................................................................ 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 73
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
C

Nồng độ enzyme

Tg

Thời gian

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam ...............................5
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid .................................................................9
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................29
Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm ......................................................................................30
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm. ............34
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu
tôm.............................................................................................................................36
Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. ...............42
Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy
phân là 6 giờ ..............................................................................................................43
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ
khác nhau...................................................................................................................44
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6
giờ thủy phân .............................................................................................................44
Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............46
...................................................................................................................................46
Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. ...46
Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ
khác nhau...................................................................................................................47

vii


Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác
nhau. ..........................................................................................................................47
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân
sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau. .............................48
Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme
khác nhau...................................................................................................................49

MỞ ĐẦU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng
chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23].
Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực
phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi. Tính
đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và
nấm men Phaffia. Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý
đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm.
Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những
ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ
cho đất nước. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành
thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi
trồng, chế biến cũng như xuất khẩu. Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu
của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng
chế biến. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu
luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Cùng với khối
lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm
cũng khá lớn. Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ
thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng
phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến. Trong phế
liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số
hợp chất sinh học khác. Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ
yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin. Đây là một cách tận
thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy,
cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu
này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Và hiện nay
cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm
bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi



Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon
Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là:
Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp
Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác
Bộ: Decaoda – Bộ mười chân
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân. Hầu hết các cơ quan

nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần
như hoàn toàn ở thân. Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng,
lipid bao phủ khung chitin. Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải
lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân. Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò
quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm. Kề
trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Chính nhờ sự
biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm. Phần đầu
thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng.
Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài.
Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp
chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat.
Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Nó được
cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit. Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ
epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp

3


Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm
2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, mặc dù tình hình
hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu
năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm...cùng với sự
chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch
tăng vào những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn
tấn. Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha,
sản lượng đạt 251 nghìn tấn. Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng
11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn. Tính trên cả nước,
trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến
năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên
650.000 tấn. Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham
gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng. Trên cả nước có khoảng 160
doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung,
Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu…), Đồng
Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà

5


Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm.
Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được
thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu
chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin.... Phế
liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn… tùy theo giống
loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản
lượng tôm khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối
lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1].

giữa phương pháp hóa học và sinh học.
Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid
và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng
chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm. Từ đó
đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất
chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp
lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.2.

Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết
rút
1.2.1. Carotenoid
Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

thực phẩm. Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả
đều là nguồn hợp chất màu tốt. Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được
tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hoặc tảo.
Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một số vi
khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid. Nhóm chất màu này tan trong
chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng. Carotenoid là một
mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23].
Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy
hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết
như là xanthophylls. Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ
50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và
không tiền vitamn A. Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một

7



trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein.
Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp
nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này. Astaxanthin có khung cấu tạo
gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy
hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α
– tocopherol [21]. Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước,
như là tôm hùm, cua, tôm. Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi
trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vật và
phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích có màu hấp dẫn để tiêu thụ.
Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin
E. Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa và chữa
bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do. Trong sự sát nhập của
astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho
cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua và động
vật có vỏ xương ngoài. Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo
Haematococus [20]. Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân
tử phức tạp với protein, carotenoprotein. Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát
[17]. Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng
cùng tồn tại [29]. Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác
nhau. Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở
nhiều động thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh
lá và vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan
trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp
với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành
ester [15]. Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong
công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật. Ngoài
ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì
hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức

10

Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và
có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26]. Phức hợp
carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững. Trong một vài trường hợp, màu

11