MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................................... x
CÁC PHỤ LỤC KÈM THEO ........................................................................................... xii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 4
1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ............................................ 4
1.1.1. Cấu tạo .................................................................................................................... 4
1.1.2. Tính chất.................................................................................................................. 4
1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel ................................. 5
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan .................................... 7
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa................................................................. 7
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan .............................................................................. 8
1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis .......... 9
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 11
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan .................................... 11
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống ........................................................ 11
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ............................................. 11
1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí .......................................... 14
1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan ......................... 15
1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men.......................................................... 18
1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................................................. 20
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 21
1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây ......................................................... 21
1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm ..................................................................... 23
1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác ........................................................................ 25
1.4. VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN................................................................... 26

2.3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................. 37
2.3.3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin ........................................................... 37
2.3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 37
2.3.4. Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan cho chủng S. paucimobilis GL12 .. 38
2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 40
2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 40
2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan ........................................................................... 40
2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 40
2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 40
2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 41
2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột ............................... 41
2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ........................................... 41
2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì ............................................................................. 42
2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản ................................................................................ 42
2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl ................................................................... 42
2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ......... 42
2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl .................................. 43
2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl ........................................... 43
2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ................................................................ 43
2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối …………… 43
2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan............................................... 44
iv


2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan......................... 44
2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng ............................................................ 47
2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa .......................... 48
2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch................. 48
2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ........... 48
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 50

3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .......................................... 83
3.4. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CÁC CHẾ PHẨM ................................................................... 85
3.4.1. Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis GL12 ........................... 85
v


3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan .................................................................................. 85
3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan ................................................................ 87
3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan ............. 88
3.4.2. Đánh giá chất lượng gellan khử acyl..................................................................... 90
3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl ................................................................... 90
3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90
3.5. THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL .................... 91
3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối .......................... 91
3.5.1.1. Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong công thức dung dịch tạo màng ... 91
3.5.1.2. Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn ............................. 93
3.5.1.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan ................................. 93
3.5.2. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ............................ 97
3.5.2.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong công thức thạch .... 97
3.5.2.2. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch.................................................... 98
3.5.2.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch ................................... 100
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 102
4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 102
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 104

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Công thức

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

ĐĐA

Mức độ deacyl

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

GFC

Sắc ký lọc gel

HDPE

Polyethylene tỷ trọng cao

MDPE

Polyethylene tỷ trọng trung bình

Bảng 1.2. Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp gellan............................................................................................................. 17
Bảng 1.3. Đặc điểm và hiệu quả gellan ............................................................................... 24
Bảng 2.1. Đặc tính của gellan và gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn ............................ 30
Bảng 2.2. Thời gian và liều lượng H2O2 khảo sát ............................................................... 38
Bảng 2.3. Các yếu tố và các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng
hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12 .......................................................................... 38
Bảng 2.4. Ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 39
Bảng 2.5. Chỉ số màu chuẩn cho chuối ............................................................................... 44
Bảng 2.6. Tỷ lệ thành phần trong các công thức tạo dung dịch màng gellan ..................... 44
Bảng 2.7. Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan chuối ................................................................ 46
Bảng 2.8. Phiếu cho điểm của phép thử cảm quan.............................................................. 47
Bảng 2.9. Bảng điểm cảm quan của sản phẩm thạch dứa ................................................... 48
Bảng 2.10. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên
trong hội đồng cảm quan ..................................................................................................... 49
Bảng 3.1. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12 ........................................................................................................... 53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng củ các xit min đến khả năng sinh tổng hợp gellan ..................... 56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan ..... 57
Bảng 3.5. Kết quả ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S.
pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 59
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phư ng s i Anov của mô hình ............................................ 60
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào
vi khuẩn ................................................................................................................................ 64
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch tới khả năng loại protein khỏi dịch lên men 65
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng
loại màu ............................................................................................................................... 67


ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) ....................................... 4
Hình 1.2. C chế tạo gel của gellan ..................................................................................... 6
Hình 1.3. C chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation ................................................... 6
Hình 1.4. C chế sinh tổng hợp gellan .................................................................................. 9
Hình 1.5. Động học quá trình STH gellan từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461........... 10
Hình 1.6. S đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men ...................................................... 19
Hình 1.7. S đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan ................................................. 20
Hình 2.1. Khuẩn lạc của S. paucimobilis GL12 (A) và S. paucimobilis GL4 (B)................ 29
Hình 2.2. Đường chuẩn gellan ........................................................................................... 32
Hình 2.3. Đường chuẩn gellan khử acyl .............................................................................. 32
Hình 2.4. Phư ng pháp xác định độ nhớt thực .................................................................... 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nguồn nit

tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.

paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S.
paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 51
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ........................................................................................................ 52
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp gellan
từ S. paucimobilis GL4 ....................................................................................................... 52
Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 ......... 53
Hình 3.6. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan
của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 55


xi


CÁC PHỤ LỤC KÈM THEO
Phụ lục 1

Hồ sơ chủng S. paucimobilis GL2 và kết quả Đánh giá độc tính cấp trên
chuột

Phụ lục 2

Các bảng và số liệu về kết quả chạy tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp
gellan từ chủng S. paucimobilis GL12

xii


MỞ ĐẦU
Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu
khí Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm,
dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm
dày và chất tạo gel.
So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở
nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều
trong sản xuất nước giải khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel
mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản
phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả
năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả.
Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao,

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4
- So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và
S. paucimobilis GL12.
2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn
- Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men10 lít
- Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột
- Nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn
3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis
- Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
- Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl
- Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl
- Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl
4. Đánh giá chất lƣợng các chế phẩm gellan
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis
- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl
- Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối
- Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa

Những kết quả mới của luận án
- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập
tại Việt Nam. Sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan có giá thành rẻ hơn thay
thế cho nguồn trypton, kết hợp với việc bổ sung theo bậc H2O2 khắc phục độ nhớt dịch
2


lên men, cải thiện phương thức cấp ôxi đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp
gellan và đạt 32,8 g/lít.

1.1.2. Tính chất
Gellan thương mại được sử dụng dưới dạng bột màu trắng, không mùi, hơi ngọt,
tan trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, aceton, ethanol…),
dung dịch có độ nhớt cao, bền ở nhiệt độ sôi, ổn định ở phổ pH rộng (3,0 – 8,0). Gellan
khử acyl có độ bền gel 300-800 g/cm2 còn gellan có khả năng giữ nước tốt. Gellan có khối

4


lượng phân tử khoảng 1 - 2 x 106 Da và gellan khử acyl có khối lượng phân tử khoảng 2 - 3
x 105 Da [38, 96].
Gellan có chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo
nhũ tương, khả năng tương thích cao, giải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi
trơn, chất tạo độ dày và huyền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel
mong muốn trong các dạng sản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng [51, 15, 34].
Gellan và gellan khử acyl có những tính chất giống nhau. Điều khác nhau căn bản
giữa hai loại gellan này là khả năng tạo gel. Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ
cho ra những gel có tính chất khác nhau. Gellan tạo gel mềm, đàn hồi và thuận nghịch
nhiệt. Sự khử các gốc acyl trong phân tử gellan sẽ tạo ra gellan khử acyl cho gel chắc,
giòn. Phụ thuộc vào mức độ deacyl mà gellan khử acyl có độ deacyl hóa càng cao thì khối
lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giòn càng tăng. Có thể
tóm tắt sự khác nhau giữa hai loại gellan này về một số chỉ tiêu chính ở bảng 1.1.[15, 16,
29, 37, 65].
Bảng 1.1. Đặc điểm khác nh u giữ gell n và gellan khử cyl [15, 16, 29, 37, 65]

Đặc điểm
Chỉ tiêu
Gellan

Gellan khử acyl


Độ nhớt giảm mạnh (+)

Khối lượng phân tử
Nhiệt độ bắt đầu tạo gel
Khả năng chịu nhiệt
Ổn định pH

Độ nhớt 1% (Cp)

1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo gel
Gellan
Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan tồn tại trong dung dịch dưới
dạng sợi cuộn ngẫu nhiên. Khi hạ nhiệt độ của dung dịch xuống, các sợi duỗi ra và xoắn
với nhau tạo ra sợi kép. Các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên mạng lưới gel 3
chiều (hình 1.2).

5


Hình 1.2. C chế tạo gel củ gell n [7, 27]

Gel gellan hình thành nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự
có mặt của các cation. Khi nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan hình thành những vòng xoắn
có trật tự, còn ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccarit dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của
dung dịch. Nhờ tính chất này, gellan sẽ được tách khỏi tế bào vi khuẩn khi xử lý ở nhiệt độ
cao. Nhiệt độ dưới 30 - 35oC, cấu trúc của dung dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình
thành gel. Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới
không gian ba chiều bằng cách tạo phức với các cation và liên kết hydro với nước. Việc bổ
sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh làm tăng số cầu muối

Tóm lại, gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra gel có tính chất
khác nhau. Gellan tự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi còn gellan khử acyl cho ra gel chắc,
giòn. Tùy thuộc vào cấu trúc và tính chất của mỗi loại gellan mà chúng sẽ được ứng dụng
cho các mục đích khác nhau. Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá cấu trúc và các đặc tính
công nghệ cho mỗi loại gellan mới sinh tổng hợp là công việc cần thiết của các nghiên cứu
thu nhận nguồn chế phẩm này.
1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Năm 1993, Takeuchi và cộng sự đã chỉ ra Sphingomonas được chia thành 4 chi:
Sphingomonassensu stricto, Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [77, 78]. Các
khảo sát đã cho thấy hầu hết các chủng Sphingomonas paucimobilis đều có khả năng sản
xuất gellan và chỉ có chủng vi khuẩn này mới có khả năng sinh tổng hợp gellan [15].
Sphingomonas sp. là vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-0,8 x 1,0-2,7
µm, khuẩn lạc có màu vàng, màu cam hoặc màu trắng không bào tử, bề mặt khuẩn lạc có
dạng nhầy, phản ứng oxidase dương tính, dị dưỡng, hiếu khí hoàn toàn và sinh sắc tố vàng.
7


Sphingomonas sp. có khả năng di động nhanh nhờ các lông roi và đa số có khả năng phát
quang dưới ánh sáng cực tím [21].
Vi khuẩn Sphingomonas được tìm thấy trong môi trường tự nhiên như trong nước,
trong đất và trong hệ thống rễ cây [76]. Nhiều tài liệu cho thấy, Sphingomonas sp. có thể
tồn tại trong nhiều môi trường sống khác nhau là do chúng có khả năng sử dụng đa dạng
nguồn cơ chất, phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 28 - 32oC và trong điều kiện thiếu dinh
dưỡng. Vi khuẩn này sử dụng glucose và một số loại đường khác cho sự sinh trưởng và
phát triển.
1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan
Con đường sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis là một quá trình khá phức
tạp, có thể chia ra làm 3 bước chính như sau: (a) sinh tổng hợp nội bào các tiền chất đường,
(b) lắp ráp các tiểu phần lặp lại tetrasaccharide, (c) quá trình polymer hóa và tiết gellan

ráp các đơn vị lặp lại được hoàn thành khi các nhóm acetate và glycerate gắn vào gốc
glucose đầu tiên nhờ enzyme acetyltransferase và glyceryltransferase, theo thứ tự [29].
c/ Quá trình polymer hóa và tiết gellan thông qua màng ngoại bào: bước tiếp theo trong
quá trình sinh tổng hợp gellan là quá trình polymer hóa những tiểu phần lặp lại để chúng
thành dạng chuỗi dài hơn. Độ dài của chuỗi gellan được quyết định bởi các enzyme thuộc
họ PCP (polysaccarit co-polymerase), được mã hóa bởi các gen gel C và gel E [63].
Bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp là sự tiết gellan ra ngoài màng tế bào.
Trong S. paucimobilis ATCC 31.461, quá trình này được thực hiện nhờ các protein trung
gian nằm ở lớp ngoài màng hay còn gọi là các protein phụ trợ, mã hóa bởi gen gelD. Các
protein này sẽ hình thành kênh protein nơi các chuỗi polysaccarit có thể tiếp cận với màng
tế bào [22].

Hình 1.4. C chế sinh tổng hợp gell n [22, 17]

1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis
Động học quá trình sinh trưởng của S. paucimobilis cũng tương tự như các vi sinh
vật khác đều trải qua lần lượt 4 giai đoạn: tiềm phát, logarit, cân bằng và suy vong. Chủng
S. paucimobilis đã được ghi nhận là loài có khả năng tiết ra một chất nhầy (gellan) bao

9


quanh tế bào như một tác nhân bảo vệ trong quá trình sinh trưởng và duy trì của chúng.
Lượng chất này sẽ thay đổi theo chu kỳ phát triển của vi khuẩn. Sau 6h lên men, tốc độ tạo
sinh khối diễn ra mạnh mẽ và đạt cực đại ở khoảng 24h. Năng suất gellan cũng tăng đáng
kể và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 60 và sau đó có xu hướng ổn định. Ở pha suy vong có
thể một lượng nhỏ polyme bị phân hủy do vi khuẩn sinh enzym zhamnose lyzae làm thủy
phân gellan. Kanar và cộng sự đã báo cáo rằng, 48h đầu là thời gian tối ưu cho sản xuất
gellan bởi S. paucimobilis. Wang và cộng sự đã quan sát thấy hàm lượng gellan đạt tối ưu
sau 56 giờ lên men. Jin và cộng sự cũng đã chỉ ra 50 giờ đầu là thời gian tối ưu cho việc

Trong nghiên cứu của Bajaj và cộng sự 2006, khi sử dụng tinh bột tan trong môi trường
nghiên cứu thì nồng độ ADP và UDP được tối ưu hóa cho sản xuất gellan ở mức 1 mM đã
cho năng suất gellan cao nhất là 32,15 g/1 [15,63].
Tóm lại, gellan được tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn S. paucimobilis sp. Khả
năng sinh tổng hợp gellan mạnh hay yếu tùy thuộc khá nhiều vào đặc điểm và các tính chất
sinh lý, sinh hóa của từng chủng. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn hay cải biến các chủng
có khả năng sinh gell n c o luôn giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
Mặt khác, là sản phẩm tr o đổi bậc h i và được tích lũy ng y từ pha logarit và kéo dài qua
pha cân bằng. Đây là điểm cần lưu ý khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng
sinh tổng hợp gellan, vừ tìm các điều kiện thích hợp cho việc tăng sinh khối vừ đảm bảo
các điều kiện tối thiểu cho duy trì chủng.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL
1.2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan
1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống
Chiều dài của pha logarit thường bị ảnh hưởng bởi lượng giống và tuổi giống. Do đó,
chất lượng giống (tuổi giống cấp, tỷ lệ giống) là một thông số cần quan tâm khi nghiên cứu
sinh tổng hợp gellan.
Nghiên cứu của Ashok Pandey và cộng sự [65] đã khảo sát thời gian lên men từ 12
giờ - 96 giờ cho sản xuất gellan và xác định được lượng gellan đạt cao nhất sau 48 giờ lên
men. Theo tác giả, gellan được hình thành ở pha sinh trưởng và tiếp tục được tạo ra nhiều ở
pha cân bằng, sự tăng trưởng tế bào đồng thời sinh tổng hợp gellan cũng được hình thành.
Để lựa chọn giống khỏe mạnh, Nampoothiri và cộng sự tiến hành tiếp giống ở các
tuổi giống (8, 12, 16, 20 và 24 giờ). Kết quả đã thu lượng gellan tối đa là 22,3 g/l khi cấp giống
ở tuổi giống 20 giờ. Cũng với kết quả nghiên cứu về các tỷ lệ tiếp giống (1, 2, 4, 6, 8 và 10%),
lượng gellan cao nhất đã thu được ở tỉ lệ giống 10%. Nhìn chung các nghiên cứu thường sử dụng
6 -10% giống và tuổi giống ở 18 - 24 giờ là thích hợp cho lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng
S. paucimobilis sp. [14, 15, 17, 37, 65].
1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
Nguồn cacbon

nguồn sucrose 40g/l, peptone 3g/l, MgSO4 3,2 g/l, Na2HPO4 7,5 g/l, KH2PO4 9,2 g/l,
K2SO4 4,3 g/l, với pH 7 [100].
Qua các nghiên cứu cho thấy, tùy vào đặc tính chủng cũng như thông số và điều
kiện lên men cụ thể mà mỗi thực nghiệm sẽ có thông số lên men tối ưu khác nhau. Tuy
nhiên, các nguồn cacbon từ glucose, tinh bột tan, maltose, saccarose, lactose là nguồn
cacbon thông dụng, an toàn cho hiệu quả tốt trong sinh tổng hợp gellan.

12


Nguồn nitơ
Nhìn chung nguồn nitơ, nồng độ nitơ và tỉ lệ C/N đều có ảnh hưởng tới sự phát
triển sinh khối và sự tạo thành sản phẩm. Dreveton và cộng sự (1996) cho rằng nguồn nitơ
thúc đẩy sự phát triển tế bào và sinh tổng hợp gellan là nguồn nitơ hữu cơ như nước chiết
ngô và các nguồn nitơ vô cơ như ammonium nitrate và potassium nitrate. Nampoothiri và
cộng sự (2003) đã so sánh các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau cho sản xuất gellan
từ chủng vi khuẩn S.paucimobilis ATCC 31461, sản lượng gellan đạt cao nhất khi bổ sung
trypton vào môi trường lên men (là 32,1 g/l). Cũng với chủng trên, Bajaj và cộng sự (2006
và 2007) đã chỉ ra, nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho hỗ trợ sinh tổng hợp gellan còn các
nguồn nitơ vô cơ chỉ hỗ trợ sản xuất sinh khối, nhưng không thể tăng sản lượng gellan. Vì
các nguồn nitơ hữu cơ còn chứa các axit amin và vitamin, nên có thể giả định rằng các
thành phần này có thể chịu trách nhiệm cải thiện năng suất của gellan. Trong số các nguồn
nitơ khác nhau được sử dụng, chỉ có chiết xuất men và peptone được tìm thấy là hữu ích.
Chiết xuất nấm men đã hỗ trợ sản xuất gellan tối đa (19,82 g/1), trong khi peptone cho
năng suất gellan đạt 18,18 g/1 vào cuối 48 giờ lên men [15, 26, 65].
Thử nghiệm của West và Strohfus (1998) lại cho thấy ngô, đậu tương có thể được sử
dụng như là nguồn nitơ để sản xuất gellan góp phần giảm giá thành của sản phẩm [94].
Tương tự Hyuck và cộng sự (2003) đã sử dụng bactopeptone và chất chiết đậu tương cho
sản xuất gellan từ vi khuẩn S.paucimobilis NK 2000, sản lượng gellan đạt 3,27 và 7,33 g/l [37].
Ngoài nguồn cacbon và nitơ thông thường, môi trường sản xuất gellan thường được

trường tối ưu, vi sinh vật sẽ có tốc độ sinh trưởng và phát triển lớn nhất. Nhìn chung, giá trị
pH tối ưu cho sản xuất polysaccarit ngoại bào từ vi khuẩn thường cao hơn so với từ nấm. Giá
trị pH thích hợp cho sản xuất gellan nằm trong khoảng 6,5 - 7,0 [26, 28, 42]. Môi trường
nhiều axit hoặc kiềm sẽ làm giảm sự phát triển tế bào và sản lượng gellan.
Ảnh hưởng của điều kiện cấp khí
Nhiều nghiên cứu cho thấy S. paucimobilis sinh tổng hợp gellan cùng với quá trình
sinh trưởng và phát triển của chúng. Nếu kiểm soát tốc độ cấp khí tốt sẽ thúc đẩy quá trình
tăng trưởng diễn ra mạnh mẽ và sẽ kéo theo quá trình sinh tổng hợp gellan cũng được tăng
cường. Do vậy, việc cấp khí cho môi trường lên men được đặc biệt quan tâm trong quá trình
sinh tổng hợp gellan.
Dreveton và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sản
lượng của gellan. Quá trình lên men được tiến hành trên hệ thống 14 lít ở nhiệt độ nuôi cấy
duy trì 30oC và pH 6,5. Ở tốc độ khuấy 250 vòng/phút là thích hợp cho quá trình lên men,
ở tốc độ khuấy thấp hơn lượng sinh khối tạo thành ít và gellan tạo được cũng không nhiều.
Giavasis và cộng sự (2006) cũng đã chứng minh ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thông khí
đến khối lượng phân tử và sinh tổng hợp gellan từ vi khuẩn S. paucimobilis cho rằng: với
tốc độ thông khí cao và khuấy mạnh sẽ làm tăng sự phát triển của vi khuẩn S.paucimobilis.
Nồng độ gellan cao nhất có thể thu được ở tốc độ khuấy 500 vòng/phút với độ thông khí 1-2
v/v/ph (12,4 g/l gellan) [26, 30].

14


Kiểm soát tốc độ khuấy và oxy hòa tan là quan trọng trong quá trình lên men hiếu
khí, đặc biệt trong sản xuất polysaccarit. Mức độ oxy hòa tan trên 10% cho thấy không ảnh
hưởng nhiều đến sinh trưởng của vi khuẩn S. paucimobilis. Ở mức độ 10%, giới hạn oxy
đã dẫn đến lượng sinh khối tạo thành thấp (3.2 g/l). Ở tốc độ lắc tối đa, mức độ oxy hòa tan
hoạt động như một lực đẩy để tăng tỉ lệ hấp thu oxy của các tế bào, dẫn đến tăng sản xuất
gellan. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dreventon và cộng sự (1996), các điều kiện
vận chuyển oxy cao thuận lợi cho sản xuất gellan. Phân tích thành phần hóa học của gellan