MỞ ĐẦU
Ở nước ta, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng
tăng; đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 692000 ha với sản lượng trên
596000 tấn, kim ngạch xuất khẩu khoảng 3 tỷ USD. Tuy nhiên ngành sản xuất này hàng
năm cũng thải ra một lượng lớn phụ phẩm giáp xác (khoảng 70000 tấn) gây ô nhiễm mạnh
mẽ tới môi trường. Do vậy, để nâng cao lợi ích kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường,
cần khai thác tận thu những thành phần có lợi từ phế liệu như chitin, protein, astaxantin.
Chitin đại diện cho polymer sinh học tự nhiên và đứng thứ hai sau cellulose, có mặt
trong vỏ xương ngoài loại giáp xác: vỏ cua, vỏ tôm,… Chitin không được sử dụng nhiều
do tính không tan trong nước.
Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine (N-acetylD-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG). NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp,
viêm dạ dày,... Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị
bệnh tự miễn dịch [69].
Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao. Xử
lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%)
và giá thành cao. Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại. Do
vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase. Công bố
sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn. Xuất phát từ nhu cầu
thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hƣớng
ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”.
* Mục tiêu nghiên cứu:
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum
20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật
* Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận
được.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm
chức năng.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo NAG

NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin. Ngoài ra nó có
trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng
ngoài. Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự
phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein
hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân.
1.1.2. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng
NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương
xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo
sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp. NAG được dùng để phục hồi lớp
sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [54].
Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm
xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác
dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn.
Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp
bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn,
tổn thương khớp, thoái hóa khớp. Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng
trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn
tính và bệnh tổn thương sụn xương [27].
Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi
khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày. NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng
mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do
vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ,
khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người.
3


Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh
viêm ruột. Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG

cách từ từ và giữ cấu trúc giống như chất có trong cơ thể người nên khả năng hấp thu cao
gấp 3 lần so với glucosamine thông thường. Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh
mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose trong máu [133]. Người ta
cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài tiết qua đường nước tiểu trong 1
ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh hóa của NAG.
4


Bảng 1.1. Ứng dụng và lợi ích của NAG

Chức năng

Đối tƣợng

Thử nghiệm

Tài liệu
tham
khảo

Điều trị
bệnh

Ung thư và di căn
Bệnh đường ruột
Bệnh rối loạn đường ruột
Tổn thương khớp

Động vật, con người
Con người

da

Vệ sinh da

Con người

[172]

Thực phẩm
bổ sung

Phụ gia trong sữa
Phụ gia trong đồ uống thể thao

Động vật, con người
Động vật, con người

[173]
[167]

Làm mỹ
phẩm

Giữ độ ẩm cho da
Tăng tính đàn hồi và màu sắc
Giảm sản xuất melanin

Con người
Con người
Con người

đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần
lượt là 76% và 98%. Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [30]. Các
nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ
phát triển của C. tainanensis khi có mặt chitin. Hoạt tính NAHase và endochitinase được
tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết. Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với
endochitinase. Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2.

Hình 1.2. Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [71].

Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose
làm cơ chất. Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay
đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và
tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao. Dùng vi sinh vật biến đổi
gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp.
1.1.3.3. Phương pháp enzym
Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym.
Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch. Tuy nhiên
chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen. Nên trong thực tế hay dùng
enzym thô thu nhận NAG.
Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn. Đầu tiên
endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị
phân giải thành các monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [127]. Sáng chế của Haynes và cs
6


(1999) tại nước Mỹ đã thu nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase)
thủy phân vỏ loài giáp xác [51].
Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và
Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG. Chitinase từ B.
cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất


Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [70]

Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi
hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate. Ngoài ra, chitin
có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA). Muối LiCNS, Ca
(CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [112].
Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% DGlucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside,
sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3).

Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị
mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc)
Chitosan + n CH3COONa
Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro.
Cấu trúc tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và
giữa các phân tử. Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận
gọi là liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị
trí cacbon - 6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương
tự như liên kết hydro trong chuỗi cellulose. Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên
kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [97]. Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng
chuỗi tinh thể chitin.

8


Hình 1.4. Liên kết hydro nội phân tử chitin [97].

Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X
[97], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin
[45], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể. Dạng chitin

sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [99].
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin
Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [23]. Chitin là hợp chất polimer
có mặt từ nhiều nguồn khác nhau. Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số
động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Ở động vật
bậc cao, chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết
trên da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc,
một số loại tảo…
Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và
mực nang. Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60%
so với trọng lượng khô [148].
Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa
học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong
thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin
[14]. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở
Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông
lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến.
Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng
đáng kể phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu. Ở Việt Nam,
hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000
tấn. Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm. Phế liệu này thải
trực tiếp ra môi trường và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn.
Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ,..) cần được tận dụng nhằm
nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế
biến thủy sản mang lại.

1.3. CHITINASE
1.3.1. Hệ chitinase
Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase
(EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C. 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase (EC

sp. P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [151].
Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [50, 77, 81, 82,
111, 159]. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC
như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [160]; từ
Serratia marcescens là 50ºC [183]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus
protuberus là 55ºC [48]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [93], hoạt độ chitinase từ
Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25
phút đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [81]. Nhiệt độ tối ưu đối với
chitinase từ Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [157]. Endochitinase và β-N-

11


acetylhexosaminidase từ A. flavus và F. oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC, nhưng các
enzym này từ P. monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [147].
Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC;
chitinase từ P. aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [20].
Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase
từ P. oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC. Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở 45ºC
trong thời gian 20 h [117]. Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P.
oxalicum hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 35ºC và ổn định ở nhiệt độ lên tới 45ºC trong thời
gian 120 phút. Hoạt tính chitinase bị mất một nửa ở 45ºC và 50ºC trong khoảng thời gian
tương ứng 53 phút và 23 phút [116].
Chitinase từ chủng vi sinh vật khác nhau hoạt động trong khoảng pH khác nhau.
Khoảng pH hoạt động của chitinase tinh sạch từ Aeromonas hydrophila H- 2330 là pH 5,0
- 8,0 [52]; từ Aeromonas sp. No. 10S-24 chitinase là pH 4,0 - 9,0 [158]; từ Bacillus sp.
BG-11 là pH 7,5 - 9,0 [17]; từ Bacillus 13.26 là pH 7,0 - 8,0 [182]; từ Bacillus sp. NCTU2
là pH 6,8 - 8,0 [165]; từ Vibrio sp là pH 4,0 - 9,0 [184]; từ Myrothecium verucaria là pH
4,0 - 6,5 [163]. Chitinase nấm mốc hoạt động trong vùng pH 4 - 7. Theo Lee và cs (2009)
công bố chitinase từ nấm sợi hoạt động tốt trong vùng axit nhẹ pH 4,0 - 7,0 [80].

chitinase tinh sạch vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính trong 18 tuần; nhưng còn lại 80% hoạt
tính khi bổ sung chất phụ gia bảo quản như Na2S2O4, KCl và glycerol và còn lại 60% hoạt
tính khi bảo quản bởi chất phụ gia NaN3. Mặt khác ở nhiệt độ phòng (từ 25 - 30ºC), không
dùng chất phụ gia bảo quản thì chitinase mất hoàn toàn hoạt tính sau thời gian 14 tuần,
nhưng hoạt tính chitinase vẫn giữ gần như 100% khi bảo quản bởi Na2S2O4, KCl và
glycerol trong thời gian 14 tuần, hoặc bảo quản bằng NaN3 trong thời gian 11 tuần [114].
1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm
tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phân tử khác nhau (diacetylchitobiose, chitotriose, chitotetraose,…), nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (NAG)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa
[123]. Sau đó 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn
hơn hay bằng 3 [(NAG)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và cho sản phẩm chính là
diacetylchitobiose (NAG)2 [38], không chứa NAG hoặc chitooligomer. β-Nacetylhexosamindase phân cắt diacetylchitobiose cũng như các polymer chitin cao hơn
gồm chitotriose và chitotetraose thành NAG [76]. Chính vì thế, nên phân biệt hoạt tính
giữa endochitinase, 1,4-β-chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng
của sự phân cắt là NAG (Hình 1.6).
Cơ chế thủy phân chitin thành NAG qua 2 giai đoạn: đầu tiên chitinase thủy phân
chitin mạch dài thành các chitooligosaccharide ngắn mạch hơn, sau đó NAHase thủy phân
chitooligosaccharide ngắn mạch ngắn thành NAG [57].
Tương tự, một số tác giả đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin bởi chế phẩm
enzym chứa cả endochitinase và NAHase thành NAG và đều cho rằng đầu tiên
endochitinase thủy phân chitin thành N-acetyl chitooligosaccharides, sau đó N-acetyl
chitooligosaccharides tiếp tục lần lượt được thủy phân bởi NAHase thành NAG [19, 145, 146].
Mặt khác, Binod và cs (2007) cho rằng thủy phân chitin thành NAG qua một giai
đoạn thủy phân thì chế phẩm enzym thô từ Penicillium aculeatum NRRL 2129 và từ
Trichoderma harzianum TUBF 927 phải chứa cả endochitinase và chitobiosidase.
Endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase
hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 thủy phân chitin thành NAG
13



môi kỵ nước hoặc chất hoạt động bề mặt sẽ làm suy yếu liên kết hydro, tương tác kỵ nước
của cấu trúc tinh thể và do đó tạo thuận lợi cho hoạt động của các enzym phân hủy [64].
Nới lỏng cấu trúc chitin bằng xử lý bởi các hydrocacbon mạch thẳng hoạt động bề mặt
(như: Triton X-100, Tween 20, hexane, heptane, nonane, decane), hydrocacbon vòng thơm
(benzene, toluene, o-oxylene, m-xylene, p-xylene), hoặc xử lý kết hợp làm nóng như đun
sôi, nồi hấp, khuấy nhiệt, hoặc kết hợp siêu âm đã được nghiên cứu. Phương pháp xử lý
như vậy giúp phá hủy cấu trúc tinh thể và tăng tỷ lệ chuyển đổi của chitin. Chitin khuấy
nhiệt ở 100ºC với urea 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; trong thời gian lần lượt 30 phút và 2 h làm
tăng tỷ lệ chuyển đổi chitin từ 7% đến 13,9% so với nguyên liệu ban đầu không qua xử lý
khi thủy phân bằng lysozyme. Ngoài ra xử lý chitin với dodecane kết hợp siêu âm giúp
tăng tỉ lệ chuyển đổi từ 4,4% đến 13,1% [64].
Bên cạnh đó, liên kết hydro và tương tác kỵ nước là cần thiết để duy trì cấu trúc ba
chiều của enzym. Các enzym phân hủy chitin có thể bị bất hoạt trong điều kiện nghiêm
ngặt. Vì vậy cần sử dụng nồng độ thấp các chất hóa học để hoạt động xúc tác enzym vẫn
diễn ra trong phản ứng thủy phân chitin [27].
Gần đây, endochitinase chịu nhiệt nóng tốt đã được tìm thấy trong dịch dùng lên men
của vi khuẩn, và có khả năng tương thích cao với chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl
sulfate (SDS) [27]. Trong tương lai, những enzym này có thể được áp dụng để nâng cao
hiệu quả thủy phân chitin.
B). Xử lý bởi tác nhân cơ học
Cellulose từ rơm rạ là polysaccharide với cấu trúc tinh thể giống chitin có thể thay
đổi mức độ tinh thể từ 74,2% xuống 4,9% bằng nghiền búa và hơn 50% cellulose từ rơm bị
chuyển hóa thành glucose khi thủy phân enzym trong điều kiện nhẹ nhàng. Rơm cắt ngắn 5
– 8 cm đưa đi nổ hơi sau đó nghiền thành bột mịn kích thước 60 µm giúp quá trình thủy
phân thu đường khử cao nhất. Tiến hành nghiền kết hợp nổ hơi có thể thủy phân 100% các
chất lignocellulose bằng enzym [150].
Nghiền tác động làm chitin thay đổi cấu trúc và mức độ tinh thể [105]. Bên cạnh đó,
sau xử lý bằng phương pháp nghiền, kích thước chitin thường giao động từ 50 µm đến 500
µm [27]. Do vậy, nghiền đã làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của chitin với enzym nên
giúp thủy phân tốt.

Chitin đã được quan sát qua sự thay đổi cấu trúc sau nổ hơi cho thấy giảm 11,28%
các chỉ số tinh thể khi xử lý với tỷ lệ chitin/nước là 0,1 g/ml [43].
D). Xử lý bởi tác nhân bức xạ
Chiếu xạ bao gồm các tia gamma, chùm tia điện tử (electron), tia bức xạ lò vi sóng.
Vi sóng có tần số 0,3 - 300 GHz nằm giữa ranh giới tia hồng ngoại và bức xạ sóng
cao tần có thể chuyển hóa năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt thúc đẩy phản ứng
hóa học và phản ứng enzym [120].

16


Tia bức xạ có thể ưu tiên phân tách các liên kết glucoside trong chuỗi phân tử. Chiếu
xạ ở mức cao có thể dẫn đến sự phân hủy các oligosaccharide và các cấu trúc vòng
glucose. Tuy nhiên, các phương pháp chiếu xạ là tốn kém và khó khăn trong việc áp dụng
công nghiệp [98].
E). Xử lý bởi tác nhân sóng siêu âm
Sóng siêu âm gây biến dạng nén giãn môi trường làm cho các phân tử liên tục bị ép
lại và giãn ra dao động xung quang vị trí cân bằng dẫn đến sinh nhiệt. Lực tác động này đủ
lớn để thắng lực hút giữa các phân tử, tạo thành lỗ vi mô trên nguyên liệu. Nếu quá trình này
xảy ra trong nước thì những lỗ đó sẽ bị hơi nước hoặc các khí hoà tan choán đầy, hình thành
bóng bọt rồi dẫn đến hiện tượng vỡ bóng bọt, tạo nhiệt độ cao trong nguyên liệu [137].
Chitosan là dẫn xuất của chitin, xử lý siêu âm làm cấu trúc của nó thay đổi bằng cách
giảm liên kết hydro giữa các phân tử và nội phân tử và làm giảm trọng lượng phân tử do
tạo thành lỗ hổng và hiện tượng vỡ bóng bọt. Khi xử lý chitosan bằng siêu âm kết hợp hóa
chất giúp giảm 22,34% đến 27,26% khối lượng phân tử ban đầu, mức độ tinh thể giảm từ
19,16% xuống 9,04%. Có thể thấy nhiều yếu tố tác động lên cấu trúc tinh thể sẽ là hiệu quả
hơn nếu kết hợp các tác động khi xử lý. Tương tự siêu âm làm giảm mức độ tinh thể của
chitin và do vậy nâng cao hiệu quả thủy phân [43].
1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase
Chế phẩm chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân chitin

pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới trung tâm hoạt động của enzym. Chế phẩm
chitinase thô từ vi sinh vật có khả năng thủy phân cơ chất chitin thành NAG trong khoảng
pH nhất định và khả năng thủy phân này đạt cao nhất tại pH tối ưu. pH tối ưu cho sự thủy
phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym từ Aspergillus sp là pH 3,5 [132], bởi chế
phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 là pH 5 [74], bởi chế phẩm enzym thô từ
Aeromonas sp. PTCC 1691 là pH 8. Khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium
oxalicum thích hợp để thủy phân chitin là 4,5 - 6,5 [116].
C). Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới khả năng thủy phân chitin thành NAG
Ở tỷ lệ gel chitin/ enzym là 10 mg/U trong điều kiện tối ưu và giữ nồng độ enzym
không đổi, Kuk và cs (2005) cho rằng chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy
phân gel chitin thành NAG đạt HSTP lớn nhất 94,9% [74]. Jamialahmadi và cs (2011)
khẳng định ở điều kiện tối ưu và tỷ lệ gel chitin/enzym là 0,5 mg/U thì chế phẩm enzym
thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận
lớn nhất 79%; khi giữ nồng độ enzym không đổi, nồng độ cơ chất gel chitin tăng từ 5 đến
10 mg/ml thì HSTP ra NAG tăng mạnh, nhưng nồng độ gel chitin tăng thêm nữa lại làm
HSTP NAG giảm xuống [57]. Sukwattanasinitt và cs (2002) khẳng định ảnh hưởng nồng
độ cơ chất lên NAG tạo thành khi dùng hỗn hợp enzym (9:1 cellulase Ac và lipase An) như
sau: tăng nồng độ β-chitin và giữ nồng độ enzym không đổi dẫn đến hiệu suất thu nhận
NAG giảm xuống. Cụ thể nồng độ cơ chất tăng từ 10 đến 40 mg/ml làm hiệu suất thu nhận
NAG giảm một nửa từ 61% xuống 28%. Và điều này đã được giải thích rằng: nồng độ cơ
chất tăng làm tăng độ nhớt, dẫn đến giảm sự khuếch tán giữa enzym và cơ chất nên HSTP
NAG giảm [144].
D). Ảnh hưởng thời gian và nồng độ enzym tới khả năng thủy phân chitin thành
NAG
Thời gian thủy phân không những ảnh hưởng đến chi phí của quá trình mà còn ảnh
hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau thủy phân. Xác định thời gian thủy phân thích hợp
sẽ giúp tiết kiệm chi phí, nâng cao hiệu suất của quá trình.
18



Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin (bột chitin mai mực kích
thước 3 µm) và α-chitin (bột chitin vỏ cua kích thước 14 μm) thành NAG với hiệu suất thu
nhận hơn 85% trong thời gian tương ứng 24 h và 168 h. Chitinase từ Bacillus licheniformis
SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h, cho hiệu suất thu nhận NAG 75%. Ở tỷ lệ
enzym/cơ chất β-chitin là U/100 mg, B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin cho hiệu suất thu
nhận NAG 90% trong 24 h thủy phân [110].
19


Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất
từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ
Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu
nhận cao [19].
Jamialahmadi và cs (2011) công bố endochitinase và exochitinase trong dịch enzym
thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [57]; Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định
endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều
hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [129].
Để enzym thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao, thì chế phẩm
enzym phải chứa endochitinase với hoạt tính thấp và β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính
cao [9, 19, 148].

1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là quan trọng và
chiếm số lượng nhiều hơn cả. Nhiều nghiên cứu thu hồi dịch chitinase thô từ vi sinh vật
như: thu hồi dịch chitinase thô từ Bacillus licheniformis SK-1, Aeromonas hydrophila
H2330 [129], Aeromonas sp. GJ-18 [74]. Aspergillus niger, Carcica papaya L và
Acremonium cellulolyticus [128], Trichoderma viride [7], từ một số chủng nấm mốc như
Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum
CFR 8 [146],..
1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase

là nguồn cung cấp năng lượng, tạo thành những tiền chất, hợp chất cacbon còn tạo ra các
quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian
hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường
một vài sản phẩm sinh tổng hợp.
Nguồn cacbon là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi
sinh vật [48, 139].
Khi bổ sung glucose, tinh bột, lamanarin, β-glucan và glycerol vào môi trường lên
men thì sinh tổng hợp chitinase từ vi khuẩn bị ức chế. Nhưng đối với nấm mốc, sinh tổng
hợp chitinase lại tăng do thêm pectin, tinh bột, lamanarin, β-glucan. Sinh tổng hợp
chitinase ngoại bào từ Fusarium chlamydosporum với hoạt độ lớn nhất khi sử dụng
saccarose 10 mM [91]. Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase gấp 2 khi môi
trường chứa arabinose (trong số các loại đường pentose và hexose), nhưng chứa glucose lại
gây kìm chế sự tạo enzym này [44]. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Vibrio
alginolyticus ở 2 g/l glucose [104], từ Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase ở 2
g/l tinh bột [162].
Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan thì vi
sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng
chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít. Muốn thu được enzym thì cần phải có
chất cảm ứng. Chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitinase là chitin.
Dạng chất cảm ứng để sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật - phân lập ở đất biển có
thể là gel chitin, vỏ cua và vỏ tôm đã xử lý [34].
Nguồn cacbon trong môi trường lên men cạn kiệt thì P. oxalicum sinh tổng hợp cả
chitinase and β-N-acetylglucosaminidase. Môi trường lên men chứa cả glucose và 6 g/l gel

21


chitin thì β-N-acetylglucosaminidase có hoạt tính cao nhất. Chitinase được sinh tổng hợp
cao nhất khi môi trường lên men chứa glucose cùng NAG hoặc 2 g/l gel chitin [117].
Kim và Ji (2001) khẳng định bột chitin kích thước từ 180 - 250 µm giúp

đó cả enzym deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [42].
22


Nguồn nitơ là cần thiết để đạt hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong lên men
sinh tổng hợp enzym. Các loại hợp chất nitơ mà nấm sợi có thể đồng hóa được thường là
cao nấm men (CNM), cao malt, cao ngô, và các nguồn nitơ vô cơ như NH4NO3,
(NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các
loài nấm tiếp hợp và ưa sử dụng nhất [138].
Nguồn nitơ là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh
vật [48, 139].
Trong sinh tổng hợp chitinase, nhu cầu nitơ về nồng độ và nguồn khác nhau đối với
từng chủng vi sinh vật. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Myrothecium verucaria trên
môi trường (g/l): cao nấm men, 0,5; pepton, 0,5. Đặc biệt bổ sung 0,03% urea thì tổng hợp
chitinase tăng gấp 4 [163]. Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi
môi trường chứa NaNO3 15 mM [91]. Aspergillus carneus sinh tổng hợp chitinase lớn nhất
ở môi trường chứa cao nấm men 3 g/l [134]. Aeromonas sp. GJ-18 sinh tổng hợp chitinase
ngoại bào cao nhất trong môi trường lên men chứa 1% tryptone [73].
Peptone 3% là nguồn nitơ tốt nhất để Pseudomonas stulzeri YPL-1 tạo chitinase
[53]. Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase cao nhất đối với Vibrio alginolyticus
chứa (g/l): pepton, 7,5 và cao nấm men, 2 [104]. 0,5% (NH4)2SO4 được xem là nguồn nitơ
tốt nhất cho Serratia marcescens XJ-01 sinh tổng hợp chitinase [171].
Môi trường lên men chứa hỗn hợp 4,0 g/l CNM và 2,0 g/l tryptone sinh tổng hợp
chitinase cao nhất đạt 6,9 U/ml từ Cellulosimicrobium cellulans 191 [88]. Alcaligenes
xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi môi trường lên men 4 g/l CNM [162].
Khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các loài Streptomyces tăng khi bổ sung
(NH4)2SO4 nhưng giảm khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [102]. Ngược lại
Bacillus licheniformis TH-1 sinh tổng hợp chitinase tăng khi bổ sung CNM vào môi trường
lên men [8] và B. pumilus [115, 154].
1.4.4. Ảnh hƣởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase

pH môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
enzym của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH- tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất,
làm thay đổi sự vận chuyển chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi
trường. Nên những biến đổi dù nhỏ nhất nồng độ của chúng trong môi trường cũng gây
những biến đổi rõ rệt về khả năng sinh trưởng và phát triển sinh vật.
Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hưởng đến hệ enzym trong vi sinh vật, tham gia
hoạt động sống của vi sinh vật. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ vi sính vật
thường trong vùng axit yếu (từ 4,0 - 6,5), vùng trung tính (pH 7,0), một số ở vùng kiềm
yếu (từ 7,5 - 9,0). Tùy vào chủng vi sinh vật mà pH tối thích của nó khác nhau.
Môi trường bán rắn sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất từ nấm sợi ở khoảng
pH 4 - 6 như từ P. oxalicum ở pH 4,1 [3], từ P. chrysogenum ở pH 4 [107], từ Trichoderna
spp ở pH 5 [5], từ Aspergillus protuberus ở pH 5,5 [48].
Ở môi trường lỏng, lên men sinh tổng hợp chitinase hoạt tính lớn nhất đối với chủng
vi sinh vật ưa axit nhẹ pH từ 3,5 - 6 như từ Aspergillus sp ở pH 3,5 [132]; từ Trichoderma
harzianum ở pH 4,9 [35] hoặc ở pH 5,6 [63]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 [93], từ
Myrothecium verucaria [163], từ Nocardia orientalis đều ở pH 5 [161], từ Talaromyces
emersonii đều ở pH 5 [93], từ Alcaligenes xylosoxydans ở pH 6 [162], ...
Một số chủng sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trường trung tính như từ
Streptomyces cinereoruber, từ Aspergillus niger [149] và từ Pseudomonas stulzeri YPL-1
24


đều ở pH 6,8 [53]; từ Bacillus lichiniformis [152], từ Cellulosimicrobium cellulans 191, từ
Aeromonas punctata HS6 đều ở pH 7 [124],..
Ngoài ra chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường kiềm nhẹ
pH khoảng 7,5 - 9,0 như từ Vibrio alginolyticus ở pH 7,5 [104]; từ Serratia marcescens
[181], từ Aeromonas hydrophila HS4 đều ở pH 8,0 [124], từ Microbispora sp.V2 ở pH 8,5
[103], từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở pH 9,0 [126],....
1.4.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym